CREB蛋白在异丙酚损害大脑发育中的作用

异丙酚是临床最常用的静脉麻醉药，中枢神经系统毒性是其严重并发症之一，主要表现为神经系统结构和功能的改变。当大脑正在经历有活力的发育改变时期时，它的神性毒性的易损性是最大的。本项目针对CREB参与调控异丙酚损害大脑发育的特点：①用酵母双杂交法筛查与CREB相互作用的蛋白，以免疫共沉淀和激光共聚焦验证这些蛋白；②构建CREB过表达或沉默表达的载体转染海马神经元原代细胞，通过间接免疫荧光、激光共聚焦等观察CREB不同表达水平下异丙酚对CREB相关分子、突触可塑性蛋白表达及神经元细胞功能的影响；③以新生大鼠为实验对象，采用Real-Time RT-PCR、免疫电镜等技术观察异丙酚对中枢神经系统CREB相互作用蛋白、突触可塑性蛋白表达及神经元生长、凋亡以及成长过程中动物行为及认知能力的影响。初步揭示CREB参与异丙酚中枢神经系统毒性的分子机制，从而为异丙酚在新生儿及婴幼儿中的应用提供临床指导。

异丙酚是临床最常用的静脉麻醉药，中枢神经系统毒性是其严重并发症之一，主要表现为神经系统结构和功能的改变。当大脑正在经历有活力的发育改变时期时，它的神性毒性的易损性是最大的。本项目构建了人胎脑cDNA文库，并用酵母双杂交法筛查了10个CREB相互作用的蛋白；体内实验中，我们以7天的新生大鼠作为实验对象，异丙酚麻醉苏醒后，将部分大鼠养至9周，应用透射电镜、水迷宫、Fluoro-Jade B染色、免疫组化、RT-PCR以及Western blot等技术观察到异丙酚损害7天和9周大鼠海马神经元和突触的结构，促进海马神经元的凋亡，PKA、CREB、Bcl-2和BDNF的表达降低，而Caspase-9的活性增加，而且9周大鼠NeuN的表达降低、空间学习记忆受损；体外实验中，通过分离胎鼠海马神经元细胞，应用MTT法、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、RT-PCR以及Western blot等方法发现异丙酚抑制海马神经元细胞的生长增殖、促进海马神经元细胞的凋亡，其机制可能与抑制Bcl-2、NF-κB和CREB的表达、增强Caspase-3的表达及影响细胞内钙离子浓度变化有关。总之，本研究初步揭示了异丙酚中枢神经系统毒性的分子机制，从而为异丙酚在新生儿及婴幼儿中的应用提供临床指导。