泡桐丛枝植原体质粒蛋白p23及寄主互作蛋白功能研究

植原体引起的泡桐丛枝病（PaWB）是我国重要的林木病害之一。目前对于植原体致病机理研究较少，防治手段也比较有限。为理解植原体致病机制，本研究在测定PaWB质粒序列，构建泡桐cDNA文库开展植原体致病相关基因与泡桐基因互作筛选取得初步结果的基础上，将从病原与寄主分子互作出发，继续开展pPaWBNy1-1ORF3编码的蛋白p23与泡桐的胞质因子家族蛋白和亚硫酸盐氧化酶的体内互作验证及其生物学功能研究，制备抗体利用免疫组织化学对其进行组织定位和免疫电镜进行亚细胞定位；构建三个基因的双元表达载体，用土壤杆菌介导的方法遗传转化泡桐，对获得的转基因再生泡桐进行Northern blot筛选鉴定，观察三种蛋白的过量表达对泡桐生长和外部形态的影响及检测其互作蛋白表达量的变化差异。本研究将有助于我们从分子和细胞生物学的水平理解植原体与寄主植物间的互作关系及致病机制，并为寻找植原体新的防治方法提供理论依据。

本研究对泡桐丛枝植原体质粒编码的三个蛋白pPaWBNy-1-ORF3、pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF3进行克隆并构建原核表达载体。原核表达获得分子量约为15 kDa的His-ORF5和分子量约38 kDa的GST-ORF4融合蛋白。纯化融合蛋白，制备了这两个融合蛋白的兔抗体。抗体鉴定发现，制备的两个抗体效价分别为1:8100和1:4096。利用制备的抗体，分析了pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4在寄主植物和介体昆虫的表达情况，发现在感病的泡桐组培苗和野外采集的感病泡桐中皆未检测到两基因的表达，而在饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约17 kDa的pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白和18 kDa 的PaWBNy-2-ORF4编码蛋白。推测pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白参与介体昆虫茶翅蝽传播泡桐丛枝植原体。利用原核表达的His-ORF5融合蛋白微注射茶翅蝽，制备了可用于体内分子互作的蛋白样本。以纯化的His-ORF5融合蛋白作为探针，用Far Western blot试验在茶翅蝽胸腹部提取的蛋白中鉴定到分子量为52 kDa和36 kDa的两个与pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白互作的茶翅蝽蛋白，而在血淋巴提取的蛋白中鉴定到分子量为52 kDa的互作蛋白。以健康泡桐RNA为模板利用逆转录PCR（RT-PCR）结合cDNA 5'-末端快速扩增法克隆了与PaWB质粒基因pPaWBNy-1-ORF3互作的泡桐亚硫酸盐氧化酶基因PfSO全长cDNA序列。生物信息学分析发现PfSO编码393个氨基酸。PfSO蛋白结构特征分析表明，氨基酸序列的N-末端含有1 个钼辅因子结合域，C-末端含有负责自身二聚化的结构域及C-末端（391-393）拥有典型的过氧化物体靶序列。检测健康泡桐和感染植原体泡桐组培苗中PfSO的mRNA表达丰度，结果显示植原体侵染的泡桐中PfSO mRNA表达量高于健康泡桐。植物亚硫酸盐氧化酶作为钼酶家族成员催化亚硫酸盐氧化成硫酸盐，在植物的抗逆过程中起着重要的作用。植原体质粒蛋白p19定位于植原体细胞膜上，而PfSO定位于过氧化物酶体，当植原体与过氧化物酶体相互靠近时，暴露于植原体细胞膜表面的p19蛋白功能位点与PfSO发生互作或是过氧化物酶体聚集在植原体周围与植原体跨膜蛋白产生互作。