Kr-h1在褐飞虱发育中的分子作用机制研究

Brown plant-hopper (BPH) is an important rice pest in China, it's also a vector for transmission of diseases such as rice grassy stunt virus (RGSV) and rice ragged stunt virus (RRSV). Adult brown planthoppers show two wing patterns: a long-wing (macropterous) form and a short-wing (brachypterous) form, the wing forms allow the transition between macropterous planthoppers that have wide distribution and brachypterous ones that deposit more eggs, which allows the BPH adapt to the environmental changes and increase the population growth. Therefore, study the development of BPH including the wing development is important for predicting the BPH outbreak accurately and analysis of the source as well as the effective control of BPH. Kr-h1 is a transcription factor of JH signaling pathway. So far, Kr-h1 genes from insects such as Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Tribolium castaneum are reported. Our previous study showed that the development of wing, external genitals and leg is severely affected by RNA interference (RNAi) of the Kr-h1, which indicates that Kr-h1 is required for the development of wing, external genitals and leg. This proposal plans to isolate interacting genes of Kr-h1 by annlyzing RNA sequencing (RNA-seq) data and yeast two-hybridization (Y2H), to study the gene function and gene interaction at the genetic, molecular and biochemical level, finally resolves the molecular mechanism of Kr-h1 in BPH development and provides important rational basis for our understanding of the JH signaling pathway and pest management in the future.

褐飞虱是我国重要的水稻害虫，也是草状矮缩病、齿叶矮缩病的传播媒介。褐飞虱的长、短翅型有利于迁飞和生殖的切换, 使种群适应环境得以延续与繁荣。因此，研究褐飞虱的发育包括翅的发育及其机制，对于准确地预报褐飞虱的暴发和分析虫源，及时有效地进行防治具有重要意义。Kr-h1是保幼激素信号传递中的转录因子，目前已有关于黑腹果蝇、赤拟谷盗、家蚕等昆虫的Kr-h1研究的报道。我们的研究表明，经过双链RNA干扰后的褐飞虱，其翅膀、雌雄生殖器及足的发育受到了严重影响，因此Kr-h1是褐飞虱的翅、足及雌雄外生殖器正常发育所需。本研究拟通过综合分析RNA干扰后的转录组数据和酵母双杂交来筛选获得Kr-h1的互作基因，进一步通过RNA干扰等多种手段在分子、遗传和生物化学水平上研究基因功能和基因相互作用，最终解析Kr-h1在褐飞虱发育中作用的分子机制，为我们理解保幼激素信号途径和今后的防治提供重要的理论依据。

保幼激素是影响褐飞虱变态和卵巢发育的重要因子，其信号的正常传递是褐飞虱变态、外生殖器发育及卵巢发育所需。本研究通过转录组数据分析比较完成Kr-h1双链RNA干扰及对照的转录组测序结果，对部分差异表达显著的基因用定量PCR进行了验证，完成了酵母双杂交诱饵载体、酵母双杂交文库的构建，及酵母双杂交实验与后续的酵母质粒提取与阳性质粒的测序分析。我们重点对Kr-h1和Met、Br、NlKIP、E93等基因的互作进行了研究。我们发现在Kr-h1和Met、Br、NlKIP、E93等基因在遗传、分子及生物化学等水平上存在相互作用。在存活率，外生殖器等组织器官的表型，变态和发育，及卵巢发育和产卵量及产卵前期等方面有相互作用，对于Vg等多个卵发育相关基因及激素相关基因的表达也有影响。此外，我们在互作基因NlKIP转基因果蝇的过表达后，观察到了果蝇平衡棒产生的显著变化，平衡棒有向翅的形态变化的趋势，但较小。蛋白互作实验表明，褐飞虱NlKIP和Kr-h1相互作用，且片段NlKIP I、II负责NlKIP和Kr-h1的相互作用，NlKIP和Kr-h1II、 V彼此相互作用。通过GST pull-down实验，表明NlKIP和Kr-h1、Kr-h1 V和NlKIP I、II，NlKIP I、II和Kr-h1具有强烈的特异性相互作用，并且还是直接相互作用。褐飞虱E93和Kr-h1相互作用。片段E93 II负责E93和Kr-h1的相互作用。此外， E93 II和Kr-h1 V彼此相互作用。E93和Kr-h1、Kr-h1 V和E93 II，E93 II和Kr-h1具有强烈的特异性相互作用，并且还是直接相互作用，进一步表明E93与Kr-h1的潜在相互作用结构域可能存在于该结构域中。我们推断NR盒（NR box）和RHF1将是负责E93和Kr-h1之间蛋白质-蛋白质相互作用的候选结构域。.因此，这些Kr-h1互作基因对于在褐飞虱的发育及保幼激素信号传递非常重要。因此，本研究为JH信号传导机制的研究提供理论依据，可用于褐飞虱的防治，最终达到控制种群的目的。