矮牵牛RCW基因调控花瓣呈色的分子机理研究

The coloration of petal is one of important ornamental characters of plants. It has been identified that most flower colors were primarily due to anthocyanin that was accumulated in the petal cells. The transcription factor complexes of WRKY, MYB, bHLH and WD40 (WMHW) can interact with each other and regulate the synthesis of anthocyanin. In previous works, we also found the gene of RCW can be regulated by the regulator complexes in Petunia. To silence RCW gene in Petunia × hybrid "M1×V30" through a RNAi process can produce more deeper violet petal. We deduced that this gene, regulated by the WMHW complexes, may be involved in the petal pigmentation process. For further verifying the assertion, we need more experiments, and therefore apply for this project. In this research, we will identify the gene function related to the pigmentation by analyzing the phenotype of the RCW- RNAi or over-expression plants. In addition, we will also carry on the gene functional analyses by for instance using the yeast-2 hybrid and BiFC to investigate the interaction of RCW and other pigmentation related proteins, and using the confocal fluorescence technique to detect RCW sub-cellular localization. The proposed project will not only deliver new components of the mechanism underlying regulation of the petal pigmentation, but also give an important foundation for further developing genetic engineering of flower color of ornamental plants.

花瓣的颜色是植物的重要观赏性状。研究表明，多数植物的花瓣呈色是花青素在花瓣细胞中积累的结果。在矮牵牛中发现，编码WRKY、MYB、bHLH、WD40的转录因子可以相互作用，形成复合体WMHW，调控花青素的合成。我们同时发现该复合体可以调控RCW基因的转录。在矮牵牛M1×V30中通过RNAi沉默该基因的表达，可以使花瓣呈现更深的紫色。因此,我们推测RCW基因受WMHW的转录调控，参与矮牵牛的花瓣呈色过程。为了进一步验证该论断，我们申请该项目。本研究以RNAi、基因超表达为手段，通过分析转基因后代的表型特征，解析RCW基因对花瓣呈色的作用；并通过酵母双杂交、BiFC、激光共聚焦显微成像等技术分析其与花瓣呈色相关基因之间的关系，鉴定RCW在细胞中作用的位置，从而阐明RCW基因的分子功能。研究结果不仅可作为花瓣呈色分子调控理论体系的有益补充，也可为将来通过分子育种手段改变花色提供重要的理论依据。

花色是植物的重要性状，在植物传粉、保护生殖等方面起着重要作用。矮牵牛的花色形成除了与花青苷合成的结构基因相关外，与花青苷调控基因及转运基因也密切相关。本研究在矮牵牛中鉴定了1个与液泡pH调控相关的基因RCW，3个与花青苷合成调控相关的R2R3-MYB型转录因子ASR1-3。在不同矮牵牛组织中进行表达分析表明，RCW基因在雄蕊、雌蕊、花瓣、叶片、根、茎、萼片中都表达，但是在花瓣中的表达随着花瓣发育逐渐增强；并且受到AN1、AN11、PH3等转录因子的调控。在矮牵牛品种‘M1×V30’和‘Blue’中进行RNAi沉默RCW基因的表达，其花瓣中的pH值与对照相比明显降低，花瓣呈现更深的紫色。对RCW编码的蛋白进行亚细胞定位发现其位于内质网-高尔基的膜系统上，表明其可能参与pH相关蛋白的转运过程。因此，RCW基因在矮牵牛花瓣细胞中的功能，主要是通过参与pH相关蛋白的转运，调控花瓣液泡中的pH环境，从而影响花瓣的呈色过程。通过比较两个矮牵牛品种基因组（Petunia inflata, P. axillaris），发现了3个新的与花青苷调控相关的MYB类型转录因子-ASRs；3个基因只在矮牵牛Petunia inflata存在，并且ASR1和ASR2发生了突变，不能正常编码；有意思的是ASR1-3基因却在矮牵牛M1、V30 和W59中都能正常编码，而在P. parodii、P. exserta及矮牵牛杂交种 W115、R27中均表现缺失。基因组线性分析及进化关系研究表明他们与AN2、AN4、DPL、PHZ等基因来源于同一祖先，并且都可以与AN1和AN11互作，形成MBW蛋白复合体。研究他们的分子功能表明，ASR1和ASR2基因主要在花瓣发育的早期表达，而ASR3只在雄蕊和雌蕊中表达，在矮牵牛进行超表达发现其可以促使转基因矮牵牛呈现更深的颜色，并正向调控花青苷相关结构基因表达。但是，他们在调控花青苷结构基因能力的大小、调控的基因类型等方面存在一定差异。总之，通过3个ASR基因的功能研究表明，植物中R2R3-MYB类型基因的突变、重组、拷贝数增加或减小是花色差异形成的重要分子基础。该项目通过研究共发表论文3篇，申请发明专利1项，发表会议论文1篇，交流学术报告1次，完成了项目制定的目标任务。研究结果进一步丰富了花青苷转运及合成调控相关的理论，可为今后花色定向育种提供重要的研究基础。