D-丝氨酸增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA活性相关机制研究

Novel antibacterial strategies are urgent for clinic treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). As it is more and more difficult in developing new drugs, researches on antibiotic sensitizer are drawing great attention wordwide. In previous studies, we found that D-serine could significantly enhance the antibacterial activity of β-lactam antibiotics in vitro and in vivo. Previous studies have suggested that amino acid composition of muropeptide in synthesizing peptidoglycan could influence the bacteria sensitivity to antibiotics. We assume that with addition of D-serine, amino acid composition of muropeptide was changed, followed by a suppressed transpeptidases activity of PBP2a and finally an enhanced antibacterial activity of β-lactam antibiotics. In this study, by using various methods, e.g HPLC-MS, ITC, we intend to detect the amino acid composition of muropeptide (especially the terminal dipeptide), and the affinity of dipeptide with PBP2a, as well as the transpeptidases activity of PBP2a after adding D-serine, to explore the mechanism of sensitization activity of D-serine in combination with β-lactam antibiotics against MRSA. The study could provide the theory basis for the combination of β-lactam antibiotics/D-serine as well as basis for biologically screen of other D-amino acids, and to broaden insights in developing novel antimicrobials.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染急需新型抗菌策略，但因新药研发困难，抗生素增敏剂成为研究方向之一。前期研究发现，D-丝氨酸在体内外均可显著增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA活性。既往研究提示肽聚糖前体中胞壁肽氨基酸组成变化可影响细菌对抗生素的敏感性。据此假设：D-丝氨酸可改变MRSA肽聚糖前体中氨基酸组成，导致其与PBP2a亲和力降低，继而抑制肽聚糖合成，从而增强MRSA对β-内酰胺类抗生素的敏感性。本研究拟采用高效液相色谱-质谱联用、等温滴定量热等方法，检测加入D-丝氨酸后胞壁肽尤其是末端二肽组成变化，末端二肽与PBP2a亲和力及晶体构象变化，并评估PBP2a合成肽聚糖活性变化，明确D-丝氨酸增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA活性的作用机制。研究结果可为β-内酰胺类抗生素/D-丝氨酸组合抗MRSA提供理论基础，为其他D-氨基酸抗菌活性筛选提供依据，也为新型抗感染药物研发拓宽思路。

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）因检出率高、耐药严重而备受关注。而抗感染药物研发周期长，费用高，研发的新药上市后收益因随后产生的耐药影响临床使用而无法弥补前期巨额投入，导致药企对抗生素研发市场意兴阑珊，因而急需新型抗感染策略。抗生素增敏剂可增强已有药物的抗菌活性，使其克服面对耐药菌呈现的“短板”，还能避免新型抗菌药物潜在的代谢和毒性问题。因此我们开展了抗MRSA菌增敏剂的研究。.前期研究我们发现D-Ser在体内外均可以显著增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA菌活性，且回补过量D-Ala可拮抗其增敏活性。因此，我们推测D-Ser可能是通过改变胞壁肽末端二肽，影响其与PBP2a蛋白结合进而干扰后者催化肽聚糖交联导致细胞壁合成受阻所致。已有研究通过HPLC-MS的方法证实D-Ser加入后胞壁肽末端二肽可由D-Ala-D-Ala变为D-Ala-D-Ser。在前期研究中我们通过Discovery Studio软件进行虚拟对接，提示D-Ala-D-Ser与PBP2a蛋白结合能力较D-Ala-D-Ala大幅降低。本项目中我们继续进行相关研究。1）荧光染料Van-FL能特异性识别并结合D-Ala-D-Ala而不与D-Ala-D-Ser结合。我们采用Confocal检测荧光强度变化，发现随着D-Ser加入，荧光强度降低，且荧光强度降低程度与D-Ser浓度正相关,证明D-Ser加入后可改变胞壁肽末端二肽；2）我们进行了MRSA菌PBP2a蛋白体外克隆表达，采用ITC的方法分别检测D-Ala-D-Ala、D-Ala-D-Ser与PBP2a蛋白结合的热力学参数，结果提示D-Ala-D-Ala与PBP2a蛋白具有良好的结合性能，而D-Ala-D-Ser与PBP2a蛋白未检测到有结合；3）我们还研究了D-Ser加入对细胞壁形态的影响。通过扫描电镜，我们发现D-Ser联用较苯唑西林单用菌体明显肿胀，且细胞破裂及内容物释放现象增多；4）考虑到未来临床应用，我们在项目执行期间进行了一项多中心调查研究，以明确目前MRSA菌药敏及分子生物学特征，筛选获得具有不同遗传背景MRSA菌，并检测D-Ser对不同遗传背景MRSA的增敏活性。研究结果提示D-Ser对于具有更高MIC水平的医院获得性MRSA增敏效果更为显著。.以上研究结果为未来D-Ser临床应用提供数据支持，为后续抗感染药物研发提供依据。