活性维生素D3对系膜细胞增殖和凋亡的调控与mTOR信号通路的关系探讨

肾小球系膜细胞异常增殖是导致肾小球硬化及肾纤维化的中心环节。研究显示活性维生素D3可抑制系膜细胞增殖、保护肾功能，但调控机制不清。本研究构建pBS/U6-VDR siRNA表达载体并转染大鼠系膜细胞，通过细胞培养技术，在增生的系膜细胞中给予活性维生素D3干预，采用CCK-8法、TUNEL法、Western blot技术及实时定量-PCR等技术，检测VDR、核增殖抗原(PCNA)和细胞凋亡相关基因Caspase3/8/9的表达，以及mTOR信号通路相关蛋白表达情况，再给予PI3K和mTOR的抑制剂，观察上述蛋白的变化，探讨活性维生素D3及其受体对系膜细胞增殖与调亡的调控作用及其靶点；建立大鼠抗Tyh1.1肾炎模型，通过动物实验进一步验证体外实验结果，确立mTOR信号通路与活性维生素D3对系膜细胞增殖与凋亡调控作用的关联，为临床广泛、合理使用活性维生素D3提供理论依据。

【摘要】背景 活性维生素D3具有广泛的生物学效应，其作用主要是与细胞内的特异性核受体（nVDR）结合而发挥生物学效应。近年发现，活性维生素D3可抑制体外培养的系膜细胞增殖，诱导系膜细胞凋亡，然而活性维生素D3发挥肾脏保护作用的具体途径及其深层作用机制尚不明确；方向 探讨活性维生素D3及其受体对系膜细胞增殖与凋亡的调控作用及其靶点，建立大鼠抗Thy1.1肾炎模型，通过动物实验进一步验证体外实验结果，确立mTOR信号通路与活性维生素D3对系膜细胞增殖与凋亡调控作用的关联；内容 完成人肾小球系膜细胞的鉴定；系膜细胞培养、系膜细胞基因芯片检测；进行LY294002和雷帕霉素干预实验，筛选其作用最佳浓度和时间，通过流式细胞术、CCK-8、Tunel法检测系膜细胞的增殖与凋亡；实时定量PCR分别检测各组细胞PCNA、Caspase-3/8/9、VDR、Akt及mTOR蛋白及其底物蛋白（p70s6K及4EBP1）的表达及磷酸化水平；建立大鼠抗Thy1.1肾炎模型，给予活性维生素D3灌胃及雷帕霉素灌胃；肾组织光镜及特染、检查系膜细胞及基质的增殖与凋亡；结果 本研通过CCK-8及流式检测发现，活性维生素D3可显著抑制人系膜细胞增殖并将细胞周期阻滞于G1期，Tunel检测发现活性维生素D3可诱导细胞凋亡；Western Blot及实时定量-PCR检测，活性维生素D3可通过下调PCNA蛋白表达、阻滞PI3K/Akt/mTOR信号通路而发挥抑制肾小球系膜细胞增殖的作用；通过上调Caspase-3/8/9蛋白的表达而诱导系膜细胞凋亡；意义 为临床广泛、合理使用活性维生素D3提供依据。