转录调控子Cj0440c对空肠弯曲杆菌耐药性和适应性的调控机理研究

空肠弯曲杆菌的耐药性和适应性是决定其危害的重要因素。据申请人博士课题研究结果和生物信息学分析，推测转录调控子Cj0440c可能在弯曲杆菌的耐药性和适应性中发挥重要调控作用。.本研究拟以转录调控子Cj0440c为研究主体，应用插入突变等分子生物学技术，构建Cj0440c的缺失和过表达突变体；体外测定缺失和过表达突变体对多类药物的耐药表型(MIC、MBC和MPC)，并在三种体内外模型中考察缺失和过表达突变体的适应性特征，综合分析Cj0440c对空肠弯曲杆菌耐药性和适应性的功能效应；采用基因芯片和定量PCR技术检测缺失突变体中的基因转录差异，分析Cj0440c的调控网络；建立Cj0440功能效应和调控网络的相关性。本研究将初步揭示Cj0440c对空肠弯曲杆菌耐药性和适应性的调控机理，为弯曲杆菌耐药性和适应性机制研究开辟新的视野，为弯曲杆菌的危害控制和风险管理提供科学参考。

本项目任务：（1）构建Cj0440c缺失和过表达突变体；（2）分析Cj0440c的功能效应；（3）检测缺失突变体转录差异，分析Cj0440c的调控网络。从而揭示 Cj0440c 对空肠弯曲杆菌耐药性和适应性的调控机理，为弯曲杆菌的危害控制和风险管理提供科学参考。 .在实验室相关老师和研究生的共同努力下，项目实验设计内容已经基本完成。.本项目采用逐步升浓度法，体外诱导空肠弯曲杆菌NCTC11168，获得红霉素耐药株。用反向PCR构建Cj0440c插入突变载体，同源重组法构建了标准菌NCTC11168（S）及其红霉素耐药株(R)的缺失突变体（SM和RM）。.以相应的母源菌（S和R）为对照组，用基因芯片技术筛选缺失突变体(SM和RM)中差异表达基因。在SM/S和RM/R组分别筛选到19和9个差异基因，两组共同的下调基因包括鞭毛基因flaB和假定基因Cj1242。SM/S组的19个差异基因中包含2个上调基因（flaA和假定脂蛋白Cj1632c）和16个下调基因（10个鞭毛基因，4个生物代谢基因，2个假定基因）。其中10个鞭毛基因(flaB、flgE-Cj1729c、flgE-Cj0043、flgLIgGHKG2, fliK)，主要参与鞭毛组装、迁移性、生物膜、自体凝集及定植侵袭的过程。4个生物代谢基因（neuB2C2, pseBC）可能参与细菌鞭毛糖基化修饰。RM/R组的9个差异基因全部是下调表达基因，包括4个鞭毛相关基因（flaBG, flgD, fliD）、1个过氧化氢酶编码基因katA和4个毒力相关的未知基因。.表型实验结果发现Cj0440c基因缺失后，空肠弯曲杆菌对各类药物的敏感性并未改变。但Cj0440c缺失突变株的体外生长力、运动和迁移能力弱于母源菌。透射电镜观察到SM菌株的鞭毛丝有断裂，RM菌株的鞭毛基本消失。Cj0440c缺失突变株在鸡肠道内具有一定的适应性代价，体内定植力和竞争生长力弱于母源菌。.因此，表型与芯片结果一致，表明Cj0440c可能通过正调控鞭毛基因或通过影响糖基化过程，参与鞭毛蛋白合成组装，影响空肠弯曲杆菌的的运动性、自体凝集性、生物被膜形成能力、宿主定植和侵袭能力等；Cj0440c还可能通过调控细菌的氧化应激，提高耐药菌抗氧化应激能力，保证耐药菌的胞内定植和生存能力。