耐高温α-淀粉酶耐酸性高活力突变体构效关系及安全高效表达研究

耐酸性高温α-淀粉酶在低pH（4.5-5.0）和高温（95-105℃）条件下可使淀粉高效液化，但目前生产和应用的耐酸性高温α-淀粉酶均难以在高温下pH4.5时稳定高效发挥其催化活力。因此，本项目以地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶为研究对象，利用蛋白质理性及非理性设计对其进行改造，构建α-淀粉酶基因突变文库，获得高温下pH4.5时高活力α-淀粉酶突变体，结合蛋白质一级及高级结构分析，整合关键氨基酸及关键位点与突变体耐酸、耐热性及催化活性的偶联信息，阐明耐酸性高温α-淀粉酶构效关系，为理性化改造糖苷水解酶第13家族中α-淀粉酶乃至其它酶分子的理化性质提供理论基础。并建立酶基因安全表达模型，通过同源重组技术将获得的高活力耐酸耐高温α-淀粉酶突变体整合到出发菌株地衣芽孢杆菌中，利用自身调控元件系统实现其安全高效稳定表达，同时采用多尺度控制技术实现其规模最优表达，为酶制剂的改造和安全高效生产提供新策略。

耐酸性高温α-淀粉酶在低pH（4.5-5.0）和高温（95-105℃）条件下可使淀粉高效液化，但目前生产的耐酸性高温α-淀粉酶均难以在高温下pH4.5时稳定高效发挥其催化活力。另外，国内外关于α-淀粉酶的研究主要集中在其温度和pH耐受性方面的改进，但对酶耐受突变体在催化活性方面的构效关系研究较少。. 本项目以目前工业生产菌株地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶（AMY）为研究对象，利用定点突变、饱和突变、易错PCR、基因组改组技术构建α-淀粉酶基因突变文库，筛选获得多个高温下pH4.5时高活力突变体：L134N、L134E、L134D、S320G、H281D、H281R、H289D、H289R、H293D、H293R、L134R/S320A、G81R/H281I、T353I/H400R、L134R/H281I/S320A/T353I/H400R。对各突变体的酶学特性和催化活性及催化动力学进行研究。在70°C、pH4.5时， L134R/S320A、T353I/H400R和H281I的Kcat/Km值分别是AMY的13.6、11和1.7倍。在高温下pH4.5时，AMY迅速失活，L134R/S320A和T353I/H400R保温60min残余活力分别为85%（70°C）和40%（90°C）。. 利用Swiss-model服务器对AMY和各突变体同源建模，采用Ramachandran图法、Verify_3D和ERRAT评价建模质量，利用Swiss PDB viewer 、PyMol和Chimera1.8.1分析突变氨基酸及位点对α-淀粉酶分子催化位点、底物结合位点、二级结构及酶蛋白整体构象的影响和突变体中疏水作用、静电场力、氢键和盐桥的相关信息，结果显示疏水作用、静电场力、氢键和盐桥对酶的活性和稳定性有重要影响。. 通过同源重组技术将获得的高活力耐酸耐高温α-淀粉酶突变体L134R/H281I/S320A/T353I/H400R整合到出发菌株地衣芽孢杆菌中构建工程菌株。通过优化培养基清液发酵和发酵过程的全程控制，实现规模化合成耐酸性高温α-淀粉酶，活力最高可达24368 U/mL。. 本项目阐明了耐酸性高温α-淀粉酶构效关系，为理性化改造α-淀粉酶的理化性质提供了理论基础，通过多尺度发酵控制技术为酶蛋白的高效生产提供了新策略。