斑蝥经光合细菌生物转化后减毒增效作用的研究

The Cantharis is an anti-tumor Chinese medicine with identified effects and broad anti-cancer spectrum,which is widely used in clinic. However,its clinical application has long been limited by its severe and frequent toxicity. Photosynthetic bacteria contains abundant nutritional materials and has a good function of biotransformation.We made a organic combination of Cantharis and Photosynthetic bacteria,which used the fuction of biotransformation of bacteria to transform the chemical ingredients of the Cantharis.Combined with the rich nutriment,we can enhance its efficacy and reduce its toxicity. Previous research in tumor cell experiment and acute toxicity test in mice has shown that the anti-tumor fuction of Cantharis is constant or enhanced after the procedure of biotransformation by Photosynthetic bacteria. And its toxicity has been obviously reduced. This project will make a systematic and deeper study on the basis of previous research,concerning the biotransformation of Cantharis' by Photosynthetic bacteria.It will contains:Working out a stable and reliable process.Clarifying the mechanism of biotransformation through testing a series of enzymes in Photosynthetic bacteria.Using finger print and Chromatographic separation techniques to research the fundamental materials,which has enhanced the effcacy and reduce the toxicity of the cantharis.Using proteomics technic to research the mechanism of the metabolites' anti-tumor fuction. This study will provide new ideas and basis to enhance the curative effect and reduce the toxicity of traditional Chinese medicine.It will also provide references of traditional Chinese medicines' biotransformation and find a new way to research and develop new drugs.

斑蝥是临床上广泛使用、疗效确切、抗癌谱广的抗肿瘤中药，因其毒性剧烈，临床应用中毒反应时常发生，限制了其临床应用。光合细菌具有良好的生物转化功能和含有丰富的营养物质。我们将毒性中药斑蝥和光合细菌有机结合，利用光合细菌的生物转化功能对斑蝥中的化学成分进行生物转化，再结合光合细菌本身富含的营养物质，达到减毒增效的作用。课题组前期研究发现，斑蝥经光合细菌生物转化后，通过肿瘤细胞实验和小鼠急性毒性实验结果显示其抗肿瘤作用不变甚至有所增强，且毒性明显降低。本课题在前期研究的基础上，对光合细菌生物转化斑蝥进行深入系统研究：建立稳定可靠的转化工艺；对光合细菌多种酶的测定阐明转化机制；应用指纹图谱和色谱分离技术对减毒增效物质基础进行研究；利用蛋白组学技术对代谢液抗肿瘤作用机制进行研究。通过本课题的研究，为中药的减毒增效研究提供新的思路和依据；为中药生物转化提供借鉴；为中药新药的开发找到一条新的途径。

利用光合细菌的生物转化功能，以斑蝥为底物，通过光合细菌自身的各类酶系等对斑蝥全成分进行生物转化，以期降低斑蝥毒性和提高抗肿瘤疗效，获得新的低毒的抗肿瘤活性物质。本课题研究了光合细菌生物转化斑蝥的工艺、斑蝥光合细菌生物转化液的抗肿瘤试验、斑蝥光合细菌生物转化的化学成分、转化产物的抗肿瘤作用，以及光合细菌生物转化斑蝥的机制探讨。实验结果证明斑蝥经光合细菌生物转化后具有明显的减毒增效作用：斑蝥水提液LD50=206mg/kg，斑蝥转化液LD50=2036mg/kg;斑蝥素的含量经过代谢后下降，说明其减毒的物质基础；对比转化前后的体内、外抗肿瘤能力，发现转化后其抗肿瘤效果优于转化前。采用电泳、HPLC等现代分析手段，测定光合细菌中酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、加氧酶活性，结果发现过氧化物酶与超氧化物歧化酶的活性表现为先上升后下降的趋势，实验组与空白组有非常显著性差异（P<0.01），均在8天达到高峰与光合细菌的代谢高峰相吻合，故认为这两个酶在代谢中起到了正向作用，酯酶在转化初期第二天，空白组和实验组的活性为最大值，随着培养时间延长，酯酶活性都表现为逐渐降低，两者有显著性差异（P<0.05）， 加氧酶代谢前后没有明显变化。因此认为前三种酶在光合细菌生物转化斑蝥的转化过程中发挥着一定的作用。 经蛋白质检测，生物转化前后光合细菌菌体的蛋白质浓度增大（P <0.01）。而通过转化液化学成分方面的研究获得了有效低毒、结构新颖的抗肿瘤的活性成分。在正丁醇部位分离出了12个化合物，由于量的限制，鉴定清楚了7个化学成分，其中化合物4为首次发现；乙酸乙酯部位分离鉴定了13个化合物，其中化合物2，3和4为新化合物，文献调查表明，除了化合物5、6和13来源于斑蝥，其余的新化合物和已知化合物均未见在斑蝥及光合细菌化学成分中报道。经过分离得到的单体化合物，其抗癌的效果不如有效部位整体的好，故将单体抗癌效果比较好的三个化合物，以组分中药的概念，还原在原药中的配比，并对该组分中药进行了研究，申报了两项发明专利。以上结果显示，本课题为中药减毒增效的研究探索了新的方法和途径。