microRNA-15b,100,182及1308在膀胱尿路上皮癌疾病进展中的作用及机制

膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤，其疾病进展情况可分为非肌层浸润性膀胱癌（Tis，Ta，T1）和肌层浸润性膀胱癌（T2以上），临床上二者的治疗方式和患者受创伤程度迥然不同。非浸润性膀胱癌可微创性地经尿道电切治疗，而浸润性癌则必须行全膀胱切除术。然而，膀胱癌的疾病进展机制尚未明确，目前在miRNA水平其疾病进展机制的相关研究较少。为此，我们实施了不同进展期膀胱癌成对样本的20张miRNA高通量芯片筛选，后经大样本qRT-PCR验证，发现miR-15b、100、182及1308在两种分期的膀胱癌中存在显著和稳定的表达差异。继而实施细胞学水平、体内实验等预实验初步验证，肯定了芯片筛查结果。本研究拟在预实验的基础上进行体外、体内研究分别探索miR-15b、100、182和1308及其靶点基因调节膀胱癌浸润性转化的作用和机制。为microRNA作为目的分子的膀胱癌诊断、治疗和预后判断提供新思路。

膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤。膀胱癌的分级和分期是重要的预后相关因子。低级别膀胱癌分化良好，高级别或肌层浸润癌分化差、容易进展和复发。目前，对膀胱癌发生发展的机制尚未充分的阐明。为了探寻更好的膀胱癌诊断和治疗的有效方法，有必要进一步研究其发病机制。MicroRNAs对于生物体的生长发育、衰老、免疫应答、肿瘤形成等各个生物学过程具有重要作用。本课题前期工作中，通过基因芯片发现miR-100在各个分期和分级的膀胱癌组织中是低表达的，miR-15b在肌层浸润性膀胱癌表达明显高于非肌层浸润性膀胱癌。扩大样本量同样验证miR-100在癌组织中的表达稳定下调，miR-15b在癌组织中的表达明显上调。体外和体内实验均表明，miR-100能抑制膀胱癌细胞的增殖。而抑制胞内miR-100的水平则促进细胞生长。该现象在裸鼠皮下种植和膀胱原位种植受慢病毒Lenti-miR-100侵染的EJ/5637细胞成瘤生长实验中得到验证。通过生物信息学手段提示mTOR是miR-100的直接靶点之一。双荧光素酶报告基因实验证实miR-100能直接结合于mTOR的3'UTR区。二者在9个膀胱癌细胞系的表达差异呈现负相关。Western blot和qRT-PCR实验验证miR-100的过表达能在mRNA和蛋白水平抑制mTOR的表达。研究同时发现，miR-100能起到类似于si-mTOR的作用，其过表达能使EJ或5637细胞周期产生Gl期阻滞，而未有凋亡能力的改变；同时，慢病毒Lenti-miR-100侵染后的5637细胞能对化学药物阿霉素更加敏感。miR-100过表达和si-mTOR均能抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。肿瘤转移模型成功构建，分析膀胱癌转移灶和原发灶组织的miR-100和mTOR及其下游基因p70S6K的表达情况，相对于原位的膀胱肿瘤，远处转移灶组织中miR-100的表达水平更低，而mTOR则上调。我们课题组另一项miR-15b的细胞功能学研究表明， miR-15b能够促进体外膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，且miR-15b能抑制膀胱癌细胞凋亡。通过信息学分析bcl-2为miR-15b的靶基因之一。western blot验证了过表达miR-15b能抑制bcl-2的表达。所以，miR-100和miR-15b有望成为膀胱癌诊断、预后判断的新因子和治疗的新工具。