Munc13-1通过与syntaxin-1相互作用促进神经递质快速释放的分子机制研究

Understanding the regulation of vesicle release is one of most fundamental questions in neuroscience research. Signal has to be transferred rapidly in normal nerve system. SNARE complex mediated vesicle fusion, which is precisely regulated by many proteins, is the known major route for signal transduction. Munc13-1, as known as an important regulator for fast vesicle fusion, severely impairs neurotransmitter release with its deficiency. Because of the complexity of its structure, the molecular mechanisms of Munc13-1 in regulating rapid synaptic vesicle fusion largely remain unclear. To discover the underlying mechanisms of Munc13-1 in fast vesicle fusion, we perform a set of experiments both in vivo and in vitro. Our preliminary results identify syntaxin-1 as the functional target of Munc13-1, and narrow down the linker region of syntaxin-1 as responsible sequence for their interaction. Further discovering key Munc13-1 interacting residues in syntaxin-1 linker region will be done in this project. With this study, we are going to clarify the mechanisms of Munc13-1 in facilitating fast neurotransmitter release via interacting with syntaxin-1 for the first time. The mechanisms of signal transduction will be gone deeper and more evidence will be uncovered in the pathogenesis of neuronal diseases.

理解囊泡分泌的调控过程是神经生物学最基本，最重要的问题之一。信号的快速传导是神经系统正常工作的基本要求，受多种蛋白精确调控的SNARE复合体介导的囊泡融合是已知实现信号快速传导的主要途径。Munc13-1是参与调节囊泡快速融合的重要蛋白，缺失该蛋白会对神经递质释放产生严重影响，但由于Munc13-1结构的复杂性，其调控突触囊泡融合的分子机制目前还不清楚。为了阐明Munc13-1调控囊泡快速融合的分子机制，本课题通过前期体内、体外实验，初步确定了Munc13-1作用的靶点分子是syntaxin-1，并锁定syntaxin-1的linker区域为相互作用区域，将继续探寻linker区域中与Munc13-1作用的具体位点。通过本课题的研究，将首次阐明Munc13-1通过与syntaxin-1相互作用促进神经递质快速释放的分子机制，加深对神经信号传导机制的理解，为研究神经疾病发病机制提供理论依据。

Syntaxin-1(Synt-1)与Munc18-1结合保持闭合构型，阻止SNARE复合物形成。已有研究表明Munc13-1的MUN结构域能打开Munc18-1/Synt-1复合物，但具体作用机制仍不清楚。我们发现Synt-1连接区域的两个保守氨基酸 (R151, I155) 是与MUN结构域相互作用的关键位点。这一相互作用是Synt-1行使体内外功能必需的，且能稳定Munc18-1/Synt-1/MUN三元复合物。在这个三元复合物中，Synt-1仍与Munc18-1结合，但其连接区域构象发生变化。Munc13-1通过改变Synt-1连接区域构象引发SNARE复合物形成。.我们还发现Synt-1表达水平与突触形成高度相关。Synt-1的R151A和I155A突变，而不是其Habc结构域或跨膜结构域影响其在突触形成中的促进作用，Synt-1可能通过激活突触囊泡释放来加速突触形成。.我们发现仅有Complexin(Cpx)附加α螺旋和中心α螺旋能激活Ca2+触发的囊泡分泌，但不能抑制囊泡自发释放。将附加α螺旋和中心α螺旋定位到囊泡能抑制自发释放，再次说明Cpx定位在弯曲的膜对抑制自发释放的重要性。.我们发现酪氨酸磷酸酶受体O亚型（PTPRO）能作为细胞黏附蛋白促进突触形成。PTPRO在脑中高表达且分布在突触后。过表达PTPRO增加兴奋性和抑制性突触，增加mEPSCs频率；抑制PTPRO表达减少兴奋性和抑制性突触，降低mEPSCs和mIPSCs频率，野生型PTPRO或其胞内序列缺失突变体能恢复这些表型，因此参与突触形成的功能需要其胞外结构域。.综上所述，本项目中我们明确了Munc13-1与Synt-1相互作用位点，发现了Synt-1可以加速突触形成，揭示了Cpx促进分泌的最小功能域，阐明了PTPRO调节突触形成的新功能，为人们深入理解神经递质释放和突触形成机制提供了证据。