complexin蛋白功能和作用机制保守性探究

Neurotransmitter release is one of basic functions of neural system. Complexins, small soluble SNARE-complex binding proteins, mediates neurotransmitter release cooperating with synaptotagmin. Suppressing the expression of complexins decreases synchronous whereas increases spontaneous and asynchronous synaptic vesicle fusion. However, the relative effect magnitudes of complexins vary between species. It raises a hypothesis that complexins may progress their functions during evolution, although it remains unknown how they work. To test how stable are the functions and mechanisms of complexins during evolution, here we try to introduce a homolog in nomastella, nvCpx, to replace complexins' functions in mouse cortical neurons. With combined electrophysiology, imaging, molecular and biochemical measurements in this study, we are going to focus how much nvCpx can perform complexin I's roles and what are the mechanisms behind it. The stability of the functions and mechanisms of complexins will be verified and the mechanisms of synaptic transmission will be gone deep into with this study.

神经递质释放是神经系统的基本功能。complexin蛋白是胞内可溶性小蛋白，能与SNARE复合体结合，通过与synaptotagmin协作调节神经递质释放。抑制complexin蛋白的表达会减少突触囊泡的同步释放，同时会增加囊泡的自发释放和异步释放。complexin蛋白的相对作用大小在物种之间有所不同。这提示我们complexin蛋白的功能可能随着物种进化有所变化，虽然具体是怎样变化的目前还不清楚。为了探索complexin蛋白的功能和作用机制在进化过程中的保守性，我们在小鼠脑皮层神经中引入一种原始生物nomastella的complexin同源物，nvCpx，替代内源性complexin。结合电生理、光学成像和分子生化等方法，探索nvCpx的功能和作用机制。通过本课题的研究，将进一步揭示complexin蛋白功能和作用机制在进化中的保守性，加深人们对神经递质释放机制的认识。

Complexin是一类可以与SNARE复合体结合的可溶性小蛋白，它在囊泡融合过程中起重要作用。脊椎动物中，complexin主要功能是激活钙离子触发的膜融合，促进突触囊泡的锚定，同时钳制突触自发释放活动。但在无脊椎动物中，complexin更多地表现出其钳制释放功能。根据这些结果人们猜想在无脊椎动物中complexin蛋白最初可能是执行钳制功能，而到脊椎动物时才进化出激活功能的。在检测complexin在进化过程中功能和作用机制的保守性时，我们研究发现将在进化上离哺乳动物非常远的刺胞动物门的星状海葵的complexin同源物表达到缺失内源性complexin的小鼠神经元中，它能很好地恢复complexin缺失引起的动作电位触发的神经递质释放能力降低，但却不能恢复神经元对自发释放的钳制。我们进一步研究还发现星状海葵的complexin同源物的结构/功能相关性与脊椎动物的complexin相似。因此，我们得出complexin的激活功能在生物进化过程中是保守的这一结论。.在研究星状海葵的complexin同源物功能的时候，我们发现与之前的研究结果一样，complexin的C端序列可能对其钳制功能十分重要。于是我们再次研究了complexin的C端结构域的作用机制。我们发现complexin的C端结构域能够与弯曲的膜相互作用。在神经元中定位于突触囊泡膜的complexin能抑制自发释放，而位于细胞质膜的complexin丧失抑制功能。不同的膜定位并不影响AMPA受体介导的动作电位触发的突触后电流，但是错误定位到细胞膜的complexin会使NMDA受体介导的突触后电流波动性增加，并影响囊泡释放的同步化。.为了在实验中高效侵染神经细胞，人们广泛使用了慢病毒。许多实验，特别是在体实验都要求浓缩与纯化慢病毒。我们发现通过蔗糖浓度梯度离心法在低于10,000 g的离心条件下就能浓缩高滴度病毒。在10%的蔗糖浓度时，超过80%的病毒都能被很好的收集。浓缩后的病毒能成功在培养的神经细胞中或直接在鼠脑中表达，且不会对实验材料造成显著影响。.综上所述，本项目中我们明确了complexin的功能和作用机制在进化过程中是保守的，阐明了complexin的C端结构域的作用机制，并优化了高滴度慢病毒纯化方法。通过本项目的研究为人们深入理解神经递质释放机制和神经疾病发病机制提供了实验证据。