联合应用促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子促进梗死心肌血管再生及其机制研究

急性心肌梗死严重威胁人类健康，尽管冠状动脉血运重建术可以快速开通"罪犯"血管，挽救濒死心肌，但这些方法只是维持存活心肌不再继续丢失，不能从根本上解决心梗造成的心肌细胞数量减少和瘢痕组织形成等问题。而心肌再生医学通过细胞因子刺激人体自然再生过程，开创新的治疗途径。本项目拟联合应用促红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），观察两者是否能加强动员自身骨髓EPCs进入外周循环，调节梗死心肌微环境SDF-1、SCF和VEGF-R2的表达，利于骨髓动员的EPCs归巢和分化，促进血管再生。并应用PI3K/Akt信号传导通路的高选择性阻断剂LY294002，观察两者联合应用是否通过激活PI3K/Akt信号传导通路，增加其下游分子VEGF表达，促进血管再生。在细胞水平和分子水平揭示联合应用G-CSF和EPO促进血管再生的机制，为临床心肌梗死的治疗提供新的理论依据。

新近研究发现，促红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对梗死心肌具有潜在的细胞保护作用，具体作用机制尚不十分清楚。目前单独应用G-CSF和EPO治疗心肌梗死的临床和实验研究结果仍存在争议。本项目按计划进行，现已完成联合应用EPO和G-CSF促进梗死心肌血管再生及其机制研究。本研究通过结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死大鼠动物模型。实验动物随机分为四组：对照组（结扎前降支1h皮下注射生理盐水）、G-CSF治疗组（结扎前降支1h皮下注射G-CSF 50µg/kg/day，连续5d）、EPO治疗组（结扎前降支1h单次皮下注射EPO 5000IU/kg）、和EPO+G-CSF联合治疗组（剂量和用法同上）。于术前及术后第1d、7d、14d和21d，应用超声心动图检测各组大鼠心脏结构和功能变化。于术前及术后第3d、5d和7d，应用流式细胞仪检测外周血中CD34+/Flk-1+ EPCs数量。心肌梗死后7d、21d收集心脏标本，采用RT-PCR和Western blotting方法检测梗死边缘心肌组织VEGF、SCF、SDF-1、MIP-1α、MCP-1细胞因子mRNA和蛋白表达。应用免疫组织化学染色法检测AMI后21d梗死边缘组织血管新生及心肌细胞凋亡情况，计算心肌梗死面积。结果显示：与对照组和EPO或G-CSF单独治疗组相比，EPO+G-CSF联合治疗能显著增加心梗后3d、5d、7d外周血中CD34+/Flk-1+内皮祖细胞数量，上调AMI后7d和21d梗死边缘心肌VEGF因子mRNA及蛋白表达，上调AMI后7d梗死边缘心肌内皮祖细胞趋化因子SCF和SDF-1 mRNA及蛋白表达，下调炎症因子MIP-1α、MCP-1 mRNA及蛋白表达。于AMI后21d，EPO+G-CSF联合治疗组大鼠梗死边缘组织新生毛细血管密度显著增加，凋亡心肌细胞明显减少，心肌梗死面积明显减小，心脏功能进一步改善。此外，与对照组相比，G-CSF单独治疗组并未显著增加外周血CD34+/Flk-1+内皮祖细胞数，也不能明显增加梗死边缘组织新生毛细血管密度和减少梗死面积。结论：EPO和G-CSF联合治疗能够增强急性心肌梗死大鼠内皮祖细胞动员，抑制心肌细胞凋亡，调节梗死心肌微环境中促血管新生因子VEGF、SCF、SDF-1、的表达，抑制炎症反应，进一步促进梗死边缘心肌血管再生，减小心肌梗死面积