双组份信号传导基因DRK1在孢子丝菌双相转换及致病性形成中的作用

孢子丝菌在温度诱导下由菌丝相向酵母相发生形态转换的过程被认为是其毒力基因表达及致病性形成的过程。我们在诱导孢子丝菌酵母相形成时的一个重大发现是菌丝相基本不表达的双组份信号传导基因DRK1在早期酵母相即显著高表达。同时我们注意到既往研究证实真菌形态形成由CAMP/PKA和MAPK信号传导通路共同完成，而二者均需被其上游的双组分信号系统激活后才能发挥作用，因此我们推断DRK1在孢子丝菌双相转换中处于上游调控位置，接受外界环境信号后陆续激活双组分传导系统、CAMP/PKA和MAPK信号通路，最终启动双相转换、毒力基因表达及致病性形成的全过程。本课题拟在前期研究基础上通过RACE技术获取孢子丝菌DRK1全长cDNA序列，采用根癌农杆菌介导的RNAi技术构建DRK1基因缺陷株，观察干扰缺陷株，对照株和野生株在形态形成，形态转换，毒力等方面的差异，以阐明DRK1在孢子丝菌致病性形成中的作用。

严格按照申请书执行，取得如下成绩：1、利用5' , 3' RACE PCR 的方法克隆了完整的申克孢子丝菌DRK1基因，其cDNA全长为4743bp，开放阅读框为4071bp，编码1356个氨基酸序列，分子量为147.3kDa，等电点为5.46。与皮炎芽生菌DRK1基因的相似度为65%。鉴定了孢子丝菌DRK1功能域，证实其由信号感受区，连接区及功能区三部分组成，是一种可溶性组氨酸蛋白激酶，未发现跨膜区。2、成功的构建了用于RNA干扰用的干扰载体PCB309-pfgrt。1500个SsDRK1的碱基被置于pCB309-pfgrt 的 PtrpC启动子之后。我们应用实时定量PCR的方法检测了干扰效率，结果表明，干扰后其基因表达水平下调接近90%。3、对DRK1基因进行了功能进一步的研究，结果发现该基因表达水平下调后：孢子丝菌的菌落生长延缓，黑色素产生减少，菌丝生长受抑制，孢子生成减少，细胞壁的组成成分发生变化，对刚果红及Zymolase的敏感性增加，下游传导通路基因Ste20、cAMP表达水平明显下调，菌株感染小鼠皮肤毒力下降。至此，我们证实SsDRK1基因在孢子丝菌的形态转换及致病性形成中起重要作用，并处于传导通路的上游位置。.除了申请书的内容以外我们还加做了与之关系较为密切的部分内容：即对MAPK通路中的Ste20基因进行了克隆分析，功能预测等研究。