双组份系统RstA/RstB影响禽致病性大肠杆菌毒力的作用机理研究

Two-component system RstA/RstB is a response regulatory system in Escherichia coli, which is composed by sensor RstB and regulator RstA. Our previous research showed that the rstA deletion from the highly pathogenic APEC strain E058 significantly reduced the bacterial virulence, implying that it may involve in virulence regulation in APEC. To explore the regulation mechanism of RstA/RstB in APEC viulence, we plan to use the pre-constructed double mutant APEC E058ΔrstAB to study its role in APEC transcriptional regulation in vivo and seek the virulence-associated genes that are directly regulated by it. We firstly analyze the differentially expressed genes between wild-type strain E058 and its isogenic mutant ΔrstAB in 1-day-old SPF chicken infection model by DNA microarray. After that, we use bioinformatics methods to predict the possible target genes directly regulated by the RstA/RstB. We then use the electrophoretic mobility shift assay and LacZ reporter fusion analysis to further validate and determine the directly regulated target genes. Finally, we construct the mutants of the target genes and clarify their role in APEC virulence. Our research will disclose the mechanism of RstA/RstB in regulation the virulence of APEC and provide new insight into the pathogenic mechanism of APEC.

双组份系统RstA/RstB是大肠杆菌的一种感应调控系统，由感受蛋白RstB和调控蛋白RstA组成。本人前期研究发现APEC强毒株E058在缺失调控基因rstA后，毒力显著下降，说明该系统可能参与APEC的毒力调控，但其作用机理尚不清楚。本项目拟利用已构建的APEC E058ΔrstAB缺失株，研究该调控系统在APEC感染SPF鸡体内的转录调控，筛选可能受其直接调控的毒力相关基因，探索该系统对APEC毒力的调控作用。首先，利用基因芯片分析APEC E058株和ΔrstAB缺失株在鸡感染模型中的差异表达基因；其次，用生物信息学方法预测可能受该系统直接调控的靶基因；然后，利用凝胶阻滞实验和lacZ报告基因融合实验分别从菌体外和菌体内来进行验证，确定直接受调控靶基因；接着，对靶基因进行缺失突变，明确其与APEC毒力之间的关系，最终弄清双组份系统RstA/RstB影响APEC毒力的作用机理。

禽致病性大肠杆菌（APEC）可以利用双组份系统（TCSs）增强其感染宿主后的适应性。前期研究发现TCS RstA/RstB中rstA基因缺失后显著致弱APEC E058株的毒力，表明该系统可能参与APEC的毒力调控，但具体机制尚不清楚。本研究旨在分析RstA/RstB介导的APEC感染宿主的体内转录表达谱，筛选其直接调控的靶基因，并明确靶基因与APEC毒力的关联，最终弄清RstA/RstB影响APEC毒力的作用机理。首先，利用1日龄雏鸡感染模型，比较了rstAB缺失株与E058亲本株感染鸡体内的转录表达谱差异，共找到198个差异表达基因，经分析发现RstA/RstB主要参与生理代谢（以氮代谢为主）、铁摄取和酸耐性等途径的表达调控。表型试验结果显示，rstAB缺失株对酸性环境敏感，而对贫铁、贫氮环境的适应性与亲本株相似；其次，通过生物信息学手段，结合文献报道的RstA结合区序列（TACATNTNGTTACA），从差异表达基因中筛选出了4个潜在的靶基因（hdeD, fadE, narG和metE），经凝胶阻滞试验和LacZ融合表达试验证实RstA可直接调控抗酸性基因hdeD的表达；最后，构建了hdeD缺失株，发现hdeD缺失后导致菌株抗鸡巨噬细胞吞噬能力、对1日龄雏鸡致病力以及3周龄SPF鸡脏器定植能力显著下降，表明hdeD是RstA/RstB调控APEC毒力的关键靶基因。本课题揭示了TCS RstA/RstB毒力调控机制，为深入研究TCSs的功能以及APEC的致病机制提供参考数据。