循环肿瘤微癌栓形成及其在肝癌转移复发中作用的机制研究

Our previous research indicated that circulating tumor cell cluster (CTC cluster) embedded a stronger potential for dissemination and metastasis in comparison to single circulating tumor cell (CTC). CTC cluster showed significant correlation with increased risk of recurrence and metastasis in hepatocellular carcinoma (HCC). However, the mechanisms underlying the forming process of CTC cluster and their initiation of metastatic lesions remains unclear. In this study, we plan to : 1) to dissect the cellular components within the CTC cluster and to analyze the phenotypic heterogeneity among tumor cells in CTC cluster; 2) Using single-cell RNA sequencing to establish CTC cluster specific gene expression profile by comparing CTC cluster from hepatic vein and peripheral vein with single CTC; 3) To enrich the key genes and pathways mediating the forming process of CTC cluster and validate their functions; 4) To enrich a CTC cluster gene panel, key genes and pathways that significantly correlated with HCC recurrence and metastasis and validate their functions; 5) To verify the prognostic significance of CTC cluster gene panel in clinical settings. In summary, the mechanism of CTC cluster forming and their initiation of recurrent or metastatic lesions are expectable from this project.

我们前期研究表明循环肿瘤微癌栓（CTC cluster）与游离循环肿瘤细胞（CTC）相比具有更强侵袭转移潜能，与肝癌术后转移复发关系密切。然而肝癌CTC cluster形成机制及其在肝癌转移复发中的作用机制尚不明了。本课题在前期工作基础上：检测CTC cluster形态学特征，分析其分子表型异质性；利用单细胞RNA-seq技术，比较肝静脉和外周静脉中CTC cluster与CTC表达谱差异，绘制CTC cluster特征性表达谱；筛选并验证CTC cluster形成的关键基因及通路；筛选并验证与肝癌转移复发相关的CTC cluster关键基因和信号通路；验证CTC cluster促肝癌转移复发关键基因作为预后预测分子标签的临床价值。本研究将进一步明确CTC cluster形成机制，阐明CTC cluster在实施肝癌转移复发过程中的关键分子机制，为临床肝癌转移复发精准防治提供新思路和靶点。

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）（简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，肝癌术后极易出现肿瘤复发和转移。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）及循环肿瘤细胞微癌栓（CTC cluster）被视为是肿瘤复发和转移的“种子”细胞，与肝癌术后转移复发关系密切。本项目通研究CTC在肝癌转移复发过程中的关键分子机制，同时利用自主研发的CTC检测平台，优化了CTC的捕获技术，探究了CTC cluster的相关临床意义，本研究阐明了CTC cluster在释放进入外周循环过程中逃避免疫系统的监视和攻击，从而成功实施转移复发，是造成肿瘤转移复发的重要原因。主要研究成果如下：1）CTC 与血小板共同形成cluster，通过血小板抑制NK细胞免疫活性从而介导免疫逃逸。试验证实CTC cluster周围包绕的血小板能通过激活Focal adhesion信号通路，上调肿瘤细胞表达CD155，从而抑制NK细胞免疫活性，促进CTC cluster免疫逃逸。进一步分析CTC cluster免疫逃逸分子机制，我们发现TIGIT能拮抗肿瘤细胞表面CD155从而抑制NK细胞免疫活性。2）肝癌中 USP1的表达与患者较差预后和更差的临床病理特征相关。研究USP1敲除的细胞系，我们发现USP1对CTC在外周生存和干性维持具有调控作用。USP1通过调控Wnt通路去泛素化TBLR1，减缓TBLR1的泛素降解过程，从而维持TBLR1蛋白的稳定，促进CTC在外周血的存活。3）通过我们自主研发的集成免疫磁微流控平台iMAC，可以以较高通量（2ml/s）和极高的捕获率（>95%）对于CTC进行捕获。通过微流控芯片内制造的永久合金微柱阵列的结构能够产生高磁场梯度，在大量血细胞中高效捕获携带磁珠的CTC结合，对于肿瘤的转移和复发具有预测价值。4）利用CTC分选平台 ChimeraX®-i120获取的大量CTC荧光图像，我们构建了一种基于机器学习的CTC捕获系统，可以通过数字化的形态学参数快速准确的识别挑取CTC。并在肝癌来源的CTC中发现上皮标志物表达较高的CTC能够预示较差预后。总的来说，本项目研究探索了CTC对于肝癌转移复发的具体机制及临床意义，为未来临床肝癌转移复发精准防治提供新思路。