阻断Dkk-1蛋白上调Wnt信号通路防治糖皮质激素性骨质疏松的研究

Wnt/β-catenin细胞内信号通路的调控在成骨细胞的分化、成熟与功能中起重要作用。Dkk-1是Wnt信号通路共受体LRP 5/6的强抑制剂，后者参与骨形成的调控。Dkk-1功能增强与抑制成骨细胞骨形成导致骨质疏松密切相关，而糖皮质激素（GC）是Dkk-1的强刺激剂。糖皮质激素性骨质疏松（GIO）是临床致残性骨代谢性疾病，目前还没有针对GIO发病机制的特异药物，从阻断Dkk-1靶点入手，可能是防治GIO的有效措施。本课题通过建立GC诱导型大鼠成骨细胞、骨髓基质干细胞（MSCs）体系，建立动物GIO模型，研究抗Dkk-1抗体对靶细胞Wnt信号通路Dkk-1及其下游基因和蛋白表达的作用，阐明抗Dkk-1抗体的体内抗骨质疏松效应。同时，通过与Dkk-1抗体对比研究，寻找Wnt通路中阻抑Dkk-1这一靶标而发挥作用的新型抗骨质疏松候选药物，为骨骼系统相关疾病发病机制和寻找防治策略开拓新手段。

根据该项目的目标和计划，通过研究Wnt/β-catenin细胞内信号通路中，筛选能够阻断Dkk-1蛋白，上调Wnt信号通路，促进成骨细胞分化成熟，促进骨髓基质干细胞向成骨分化的途径的有效化合物和药物，防治糖皮质激素性骨质疏松，为寻找抗骨质疏松新药与新治疗方法提供实验依据，并为临床转化研究奠定科学基础。项目已完成包括：.①用成骨细胞系、骨髓基质干细胞为靶细胞，以Wnt/β-catenin信号通路中负性蛋白DKK-1和正性蛋白β-catenin的基因表达，在体外筛选能抑制DKK-1的有效候选化合物，结果发现了丹参多酚类化合物（中药丹参的主要水溶性抗氧化成分丹参素和丹参酚B可以对抗高浓度糖皮质激素诱导的Wnt/β-catenin紊乱，下调DKK-1，上调β-catenin的mRNA表达，从而促进成骨细胞分化，促进骨基质和骨矿的形成；.②通过糖皮质激素诱导的骨质疏松模型，在动物体内观察候选药物的抗骨质疏松机制。结果糖皮质激素诱导的骨质疏松大鼠骨形成明显受到抑制，骨吸收变化不大，骨量下降，骨生物力学性能下降，丹参素和丹参酚B有效对抗糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松，其机制通过促进骨形成，抑制骨髓脂肪分化，促进骨髓微血管形成和开放，该作用可能与抑制DKK-1，上调β-catenin的mRNA表达有关；.③研究抗DKK-1单克隆抗体分别对骨细胞和骨质疏松动物模型的作用，比较候选药物丹参素和丹参酚B的作用，从而进一步阐明阻断Dkk-1蛋白上调Wnt信号通路防治糖皮质激素性骨质疏松的理论机制。结果发现抗DKK-1抗体可以完全阻断糖皮质激素诱导的MC3T3-E1细胞的DKK-1mRNA的表达，丹参酚B的作用与抗DKK-1抗体相似，但效应比抗DKK-1抗体弱。抗DKK-1抗体体内给药3个月后，能对抗糖皮质激素诱导的大鼠骨形成抑制作用，增加骨矿沉积率，增加骨密度，提高骨生物力学性能，提高骨质量；.④以上研究得出结论（成果）：通过以Dkk-1蛋白靶点的研究，发现中药丹参的主要水溶性抗氧化成分丹参素和丹参酚B可通过阻断Dkk-1蛋白上调Wnt信号通路防治糖皮质激素性骨质疏松，其优势是可以避免生物大分子抗体的昂贵、副作用多的缺点，成为防治骨质疏松的新的治疗手段。丹参素和丹参酚B是否用于临床实践有待进一步研究。