穿龙薯蓣皂苷调控HIF-1/Notch网络串联信号干预再障骨髓T细胞分化的机制研究

T cell function abnormality is a key pathogenesis of aplastic anemia (AA). Regulatory T cells (Tregs) are important components of immune balance; Notch family plays an important role in T cell differentiation, and maintain Tregs function; hypoxic exists in normal bone marrow microenvironment, which is an important induction signal of hematopoiesis. Therefore, we hypothesized that the interaction between hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and downstream effector molecules and Notch signaling may affect bone marrow hematopoiesis. Based on our previous research, we choose total saponins from dioscorea nipponica (TSDN) as research object, establish the animal model and simulate the bone marrow microenvironment in vitro. Using Immunohistochemistry, FCM, Realtime RT-PCR, Western blot and gene chip to detect the effect of TSDN on Tregs differentiation, Notch pathway, HIF-1 and downstream effector molecules. Pathway method was applied to analyze the correlation between HIF-1 / Notch network, AA and treatment. We try to analysis the mechanism of TSDN treat AA and provide scientific experimental basis for its clinical application.

T细胞功能异常是再生障碍性贫血（AA）的关键病机，调节性T细胞（Tregs）是免疫平衡的重要构成部分；Notch信号可调控T细胞分化的多个交叉点，对维持Tregs功能具有重要作用；正常骨髓内存在低氧微环境，是造血的重要诱导信号。故我们提出假说：低氧诱导因子-1（HIF-1）及下游效应分子表达与Notch信号的相互作用可能影响着骨髓造血功能。结合前期研究成果，本课题以穿龙薯蓣皂苷（TSDN）为干预药物，建立再障小鼠模型；采集初诊再障患者骨髓，体外模拟骨髓造血微环境，采用免疫组化、TUNEL、FCM、Realtime RT-PCR、Western Blot、基因芯片等方法，检测TSDN对再障Tregs分化、Notch通路、HIF-1及下游效应分子的影响；采用Pathway分析HIF-1/Notch网络与再障和药物间的相关性，试图解析TSDN治疗再障的部分作用机制，为其临床应用提供科学实验依据。

按照研究计划，我们对再生障碍性贫血（AA）免疫异常的关键病机，T细胞免疫进行了深入研究，从在体、离体多角度发现并证实了穿龙薯蓣皂苷通过影响HIF/Notch信号之间网络交联，多靶点调节T细胞分化，发挥改善免疫稳态、促进骨髓造血功能恢复的作用。做了以下工作：. 在体水平，1.优化AA小鼠模型，证实穿龙薯蓣皂苷能够改善AA小鼠外周血象并促进骨髓增生。2.穿龙薯蓣皂苷可提升AA小鼠外周Treg比例，降低Th17比例，增强Foxp3、抑制RORγt表达，从而恢复Th17/Treg失衡。3.穿龙薯蓣皂苷可增强AA小鼠脾脏Notch1、Jagged1基因/蛋白表达，降低Dll4基因/蛋白表达，并提高RBP-Jκ与Foxp3蛋白结合量、降低RBP-Jκ与RORγt蛋白结合量，从而促进T细胞向Treg分化。4.穿龙薯蓣皂苷能够下调骨髓NF-κB、STAT3基因及蛋白表达，减轻骨髓过度炎症水平。增加AA小鼠HIF下游分子SDF-1/CXCR4蛋白的表达，激活HIF通路。5.穿龙薯蓣皂苷可上调再障小鼠骨髓Notch1、DLL-1、Hes1、Hey、RBP-Jκ、Jagged1蛋白水平，促进AA小鼠骨髓NICD与HIF-1α蛋白结合，从而增强HIF与Notch的交联，调节T细胞分化与迁移。. 离体水平，1.原代培养人源BMSC与T细胞进行共培养，建立体外骨髓微环境模型。2.发现穿龙薯蓣皂苷在体外可诱导T细胞向Treg分化，上调Foxp3，下调RORγt，恢复Th17/Treg失衡；调节细胞因子分泌，增加TGF-β、IL-10、IL-2的分泌，减少IL-17的生成3.穿龙薯蓣皂苷体外可抑制BMMCs凋亡，降低再障小鼠骨髓造血干租细胞表面Fas水平，并下调Fas、FasL、Bax、Caspase3蛋白的表达，增加Bcl-2表达，抑制骨髓造血干祖细胞细胞凋亡，维持骨髓微环境稳态。4.穿龙薯蓣皂苷能够上调Notch1、Jagged1、DLL-1、Hes1、Hey、RBP-Jκ蛋白表达，并能促进NICD与HIF-1α结合，提示穿龙薯蓣皂苷在体外水平能够促进HIF/Notch的相互作用。5.骨髓间充质干细胞进行HIF-1a siRNA转染后，发现穿龙薯蓣皂苷仍然能够上调Notch1、Jagged1蛋白表达，证明了穿龙薯蓣皂苷具有多靶点调控作用。