基于宏基因组/表面展示技术的芳烃污水生物资源化处理及调控策略研究

对污水中所含的有用物质进行资源化回收处理，是实现水资源可持续利用的必然选择。本项目以芳烃为研究对象，采用宏基因组/表面展示技术制备全细胞催化剂，并对其进行人为定向改造，用于芳烃污水资源化处理体系，内容包括:(1)优化宏基因组筛选方法，获取芳烃定向转化的靶基因；(2)利用表面展示技术进行靶基因的高效表达，制备全细胞催化剂，并考察其催化活性、应用的限制条件及催化底物多样性；(3)通过同源建模及分子对接对酶进行理性设计，建立资源化处理体系的调控策略。.本研究属于环境工程、生物工程及化学工程的交叉领域，意义在于:(1)将宏基因组与表面展示技术结合制备新型高效全细胞催化剂，实现对芳烃污染水体定向转化及资源化处理；(2)从基因来源、蛋白表达及代谢工程三个层面对芳烃污水资源化处理体系进行优化调控，为芳烃类污水资源化处理体系的构建及运行提供参考依据，加速芳烃污水资源化的研究进程。

芳烃污染是世界性环境难题，相比较传统的生物降解，芳烃资源化研究不仅环境友好，而且具有经济效益，属于难降解污染物处理的前沿研究领域。本课题围绕芳烃降解酶资源的获取、表达与改造，以及芳烃污染物的资源化开展了一系列工作，具体有：1. 耦合宏基因组及纯培养技术获取酶资源。优化宏基因组技术处理流程，成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库，并获取了宏基因组2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶 (BphC_meta)，结合同源模建对BphC_meta结构功能关系进行了研究，证明底物的取代基类型及位置对酶活性具有重要影响。利用纯培养技术获取了联苯双加氧酶、苯酚羟化酶和萘双加氧酶，并构建了相应的基因工程菌AB_IND、PH_IND和ND_IND。2. 利用芽孢表面展示技术成功实现芳烃间位开环产物水解酶BphD和MfphA的高效表达。体系能在80 oC和pH 10的条件下保持80%相对活性，重复利用性好，应用潜力较大。3. 制备多种生物催化剂实现芳烃资源化。利用PH_IND、AB_IND和ND_IND实现吲哚 (污染物) -靛蓝 (高价值染料) 的转化，并发现一条新颖的吲哚转化路径，为吲哚转化合成靛蓝的理论研究提供新的思考。利用PH_IND实现苯/甲苯 (污染物) -邻苯二酚 (医药中间体) 类物质转化，并构建了对位取代苯酚的PH_IND-BphC多级转化体系，实现了污染物的定向生物转化。4. 引入生物信息学技术指导酶的定向改造与应用。利用同源模建和分子对接技术证实BphD和MfphA具有催化混杂性，通过理性设计和区域互换实验表明其选择性由lid域决定，进一步饱和突变实验首次证实非活性位点残基Met148可以调控间位开环产物水解酶的活性。将分子模拟技术与固定化酶技术相结合以增强催化剂的稳定性，研究表明介孔分子筛SBA-15和单壁碳纳米管固定化的MfphA和BphC催化性能显著提高。拓宽芳烃加氧酶应用领域，首次构建了以BphC为传感元件的生物传感器及量子点荧光传感体系，成功实现邻苯二酚的低浓度检测。通过本立项研究，成功构建了多种稳定高效的催化体系，为废水中污染物的资源化应用及精细化学品合成提供了一种新的研究思路，具有较大的理论价值及应用前景。