应力相关Ihh/PTHrP信号轴调控腱止点复合界面软骨层形成的研究

恢复生理性腱止点是治疗腱止点损伤的关键，目前尚不能重建其特有的"纤维-软骨-钙化层-骨"界面，软骨层是其中最重要功能部分。文献证实应力刺激是界面发育的促进因素，但信号通路不明。近年发现应力相关蛋白PTHrP可促进软骨细胞增殖和软骨层发育;Ihh可受应力调节促进Gli3核转录，故具有上调PTHrP分泌的潜力，我们研究发现Ihh在增殖期软骨细胞中高表达，可能是PTHrP的上游分子，据此提出假设：应力可刺激Ihh分泌，影响Gli3转录上调PTHrP表达并作用于增殖期细胞PTHR1受体，抑制细胞成熟，促进软骨层形成。设计以下研究内容：①PTHrP蛋白促进发育龄兔腱止点软骨细胞增殖；②离体细胞牵拉实验对发育龄兔腱止点软骨细胞内Ihh/PTHrP信号轴表达的影响；③兔活体应力刺激对腱止点软骨层厚度的促进作用。结果可望初步揭示腱止点界面的发育机制，为其生理性重建的治疗提供全新的理论基础和技术支持。

按照实验计划已经，完成了猪跟腱止点细胞（纤维软骨细胞）的获取、培养、鉴定及生物学观察。体视显微镜下切取贵州迷你小香猪跟腱止点纤维软骨层组织并剪碎，经过胰蛋白酶和II型胶原酶两步酶消法，后在含10% FBS的DMEM进行培养和传代，使用HE、阿利新蓝、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。成功分离和培养了猪跟腱止点纤维软骨层细胞，并通过不同染色方法进行了联合鉴定。 本实验建立一种简便可靠的腱止点纤维软骨细胞分离培养方法。 .同样，我们在细胞实验中证实纤维软骨层细胞持续表达ColⅠ, ColⅡ, ColⅩ, Ihh and PTHrP。在细胞循环加载的生物力学实验中，ColⅠ, ColⅡ, ColⅩ, Ihh and PTHrP的表达和分泌与循环加载的时间和幅度相关。在细胞拉伸实验中，随拉伸时间的延长表达量均增加（P<0.05）4%优于8% and 12%, 12%表达最低（P<0.05）。colⅩ随拉力的增加表达增加。在12%，1Hz的拉伸条件下，COX的表达和分泌明显上升（P<0.05）。加入Cyclopamine可抑制ColⅠ, ColⅡ, ColⅩ的表达，细胞的增值；PTHrP对ColⅠ, ColⅡ, ColⅩ的表达有促进作用；加入PTHrP对Ihh的表达促进作用不强。同时加入Cyclopamine和PTHrP后，PTHrP对ColⅠ, ColⅡ, ColⅩ的表达有促进作用明显增强（P<0.05）。.得出了初步结论：.1、纤维软骨细胞受细胞应力刺激影响，应力刺激也调节细胞的Ihh和PTHrP表达。.2、Ihh通过PTHrP调节细胞的增值和分化， PTHrP对Ihh的表达促进作用不明显。.3、加入Ihh抑制剂Cyclopamine和加入PTHrP后均能促进COLX的表达和分泌并促使腱止点界面纤维软骨层细胞向老化退变方向发展。.因而可初步得出结论，应力刺激可通过Ihh/PTHrP对纤维软骨细胞的增殖发育进行调控，可推断其对生理性腱止点的发育起着重要调控作用。为下一步实验提供了重要的理论依据。