癌蛋白iASPP在卵巢癌耐药机制中的作用及相关通路研究

Chemoresistance is common in the patients with ovarian cancer,which is a hotspot in research field,recently. Our previous study showed that overexpression of oncoprotein iASPP in ovarian cancer plays an important role in chemoresistance. Laboratory evidences suggested that its mechanism on drug resistance may be related to securin / CDK1 / cyclin B1 / separase pathway. In this study, in vivo and in vitro experiments are designed to demonstrate the effects of iASPP on this pathway to escape the mitotic catastrophe induced by paclitaxel(one of the first-line drugs), followed by chemoresistance and poor outcome.At the same time, RT-PCR is used to screen downstream target genes of iASPP,and luciferase reporter assay and chromatin immunoprecipitation are performed to verify the transcriptional functions of iASPP.By using confocal microscopy combined with immunofluorescence and coimmunoprecipitation,the protein-protein bindings of iASPP and the members of this pathway were screened and validated. The aim of this subject is to elucidate the effcets of iASPP on securin / CDK1 / cyclin B1 / separase pathway,especially in relation to chemoresistance in ovarian cancer.

卵巢癌患者的耐药性很常见，相关领域研究一直是热点及难点。我们前期工作发现异常高表达的癌蛋白iASPP在卵巢癌中发挥重要耐药作用，试验室证据提示其耐药机制可能与securin/CDK1/cyclin B1/separase信号通路有关。本课题拟设计体内、外实验进一步证实iASPP通过该信号传导通路逃避细胞危象，从而发挥抵抗紫杉醇（卵巢癌一线化疗药）的作用；同时采用RT-PCR技术筛选外源性导入iASPP后呈明显差异表达的该通路靶基因，运用荧光素酶分析和染色质免疫共沉淀法验证iASPP的转录调控功能；运用激光共聚焦显微镜结合免疫荧光法及免疫共沉淀法筛选并验证iASPP与目标通路的结合蛋白。本课题旨在阐明iASPP通过securin/CDK1/cyclin B1/separase信号通路发挥耐药性的作用机制，为预测耐药及复发卵巢癌患者的分子靶向治疗积累资料。

研究背景.上皮源性卵巢癌（ovarian cancer）约占卵巢恶性病变的90%，其病死率居妇科恶性肿瘤首位。究其原因，卵巢癌的耐药性很常见，相关领域研究一直是热点及难点。本课题组采用患者血清中紫杉醇浓度的平均值体外诱导卵巢癌细胞株死亡，结果发现在该剂量下，癌细胞以分裂危象（mitotic catastrophe）为主要死亡途径。实验室证据提示iASPP的耐药机制可能与securin/CDK1/cyclin B1/separase信号通路异常所导致的癌细胞分裂危象减少有关。.主要研究内容.明确iASPP通该信号通路逃避细胞分裂危象；筛选并验证iASPP在目标通路的靶基因或结合蛋白。.重要结果、关键数据及其科学意义.（一）高表达iASPP预示卵巢癌患者可能耐药，预后更差。.（1）完成临床病例收集，分析临床病理特征，随访已完成约90%。.（2）免疫组化: 我们观察到iASPP主要表达于癌细胞胞浆，少部分表达在胞核（图1），提示iASPP可能具有多种功能。统计学分析结果显示，高表达iASPP提示更差的总体生存率（OS）和无病生存率（DFS）；iASPP在耐药组中表达高于化疗敏感组以及部分敏感组。.（二）高表达的iASPP与separase的高水平表达具有相关性；而与securin、CDK1的低水平表达相关。.（1）体内实验：免疫组化统计学分析结果提示iASPP的表达水平与separase呈正相关；而与securin、CDK1呈负相关。.（2）体外实验：运用Western杂交法检测转染外源性iASPP前后的separase、securin、CDK1以及cyclin B1的蛋白质表达水平，结果同上。.（三）iASPP不能在转录水平上影响securin/CDK1/cyclin B1/separase的mRNA水平，提示它们可能在蛋白质水平上存在对话。.（1）利用RT-PCR检测转染外源性iASPP前后securin、CDK1、cyclinB1和separase的mRNA转录水平，未发现阳性结果。.（2） 构建荧光素酶表达载体并与iASPP质粒共转染癌细胞株，结果同上。.（四）已完成寻找iASPP在目标通路结合蛋白的基础工作.本课题的科学意义在于为预测耐药及复发卵巢癌患者的分子靶向治疗积累资料。