Reptin在逆转卵巢癌紫杉醇化疗耐药中的作用及相关机制

Paclitaxel is widely used for the first-line and second-line treatment of clinical ovarian cancer. Unfortunately, more and more patients become resistance to the paxlitaxel chemotherapy, which restricts its clinical use. As we know, paclitaxel induces microtubules depolymerization and blocks cell division which cause tumor cell death. Research over recent years identified untimely inactivation of the spindle assembly checkpoint（SAC）as a determinant of the efficacy of paclitaxel in killing human cancer cells， but the mechanistic details remain unclear. Our early investigation found that p31comet could specifically induce SAC inactivation and ATP protease Reptin was first confirmed as the regulatory gene of P31comet. This finding suggests that Reptin may influence the sensitivity to paclitaxel chemotherapy by Reptin/P31comet /SAC pathway. Base on this point, we'll explore the role of Reptin in the reversal of ovarian cancer resistance to paclitaxel chemotherapy by both in vitro and in vivo experimental models. Targeting the pathway we are working on is not only a greater understanding of how these classic antimitotic agents bring about cell death, but also a wealth of potential new targets of clinical anticancer therapeutics.

临床上，卵巢癌患者对紫杉醇耐药的现象时有发生，是导致化疗失败及复发的主要原因。众所周知，紫杉醇主要通过作用于细胞纺锤体，阻断细胞的正常分裂而达到抗肿瘤作用。有研究表明，细胞纺锤体检测点（spindle assembly checkpoint,SAC）功能过早失活的肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性强于SAC功能正常的细胞株。我们前期研究提示：P31comet可以特异性介导SAC失活；并首次证实Reptin是调控P31comet功能的上游基因，但其机制国内外未见相关报道。我们推测Reptin可能通过P31comet来调节SAC的活性，进而影响机体对紫杉醇化疗的敏感性。因此，本文将通过一系列体内外实验来探讨Reptin/P31comet基因在逆转紫杉醇化疗耐药过程中的作用及机制，进一步揭示并完善SAC与紫杉醇化疗耐药发生的机制，为临床上对紫杉醇化疗耐药的患者用药提供新思路和药物作用的新靶点。

课题前期进行了一些细胞株的筛选、质粒的构建、效应的验证及药物浓度的摸索，我们发现P31的缺失导致27%的Hela细胞有丝分裂期平均延长1.8个小时，然后这些细胞在有丝分裂期死去；剩下的P31-siRNA Hela细胞均不同程度的出现了有丝分裂期延长（~40min），然后这些细胞均能正常的完成细胞分裂细胞完成有丝分裂的时间延长，主要是中后期延长;同时，我们还发现实验组中那27%的死于有丝分裂期的细胞中约50%的细胞死亡时处于有丝分裂中期。这些数据都说明P31在细胞完成正常有丝分裂的中后期是必不可少的,这与reptin缺失后细胞的表型是一致的。为了明确P31在这个过程中的角色，我们通过细胞学流式、免疫共沉淀及染色等一系列的研究，发现P31可以促进Mad2-Cdc20的解离进而导致MCC的失活，而且P31的这种作用是不依赖于蛋白水解酶活性的，也不依赖于cdc20泛素化的。我们在课题研究过程中发现Aurora激酶抑制剂VX680对细胞周期及增值有影响，并进行了相关的研究。通过研究，发现VX680可诱导细胞发生G2/M阻滞，同时发现八倍体细胞数目增多但是细胞凋亡却没有随之增加。通过后续的蛋白印记实验，发现在此过程中Bcl-2的表达的确没有明显改变，但是磷酸化P38的表达随着增加，说明P38MAPK信号通路在此过程中发挥着一定的作用。为此，我们使用p38MARK的抑制剂birb796通过cck8试剂盒和克隆形成实验检测p38mark被抑制后vx680对细胞增殖的影响，实验结果提示：birb796抑制p38mark的功能后，vx680对细胞增殖的抑制作用明显增强。western blot和免疫染色结果均提示在此过程中，一些相关的凋亡的marker表达增加，提示：birb796可以增强vx680诱导的DNA损伤和宫颈癌细胞凋亡。我们也进行了体内试验，均证实联合使用Aurora激酶抑制剂vx680和birb796可以明显增加凋亡基因的表达，明显缩小小鼠的肿瘤体积，这一成果国内外尚未见报道，对于临床化疗耐药的患者有积极的指导意义。