新疆沙枣叶中昆虫酚氧化酶抑制剂的分离鉴定及其功能研究

Phenoloxidase is a key enzyme of insects, which can take part in many physiological process. Screening of insect phenoloxidase inhibitors is helpful to the development of the newly “pest control agent”, which acts on phenoloxidase, a novel mode of action. Elaeagnus angustifolia L. is rich in plant resources in Xinjiang. However, there was little research in insecticidal active components from the leaves of Elaeagnus angustifolia L. The results of our earlier experiments showed that crude extracts from the foliage of Elaeagnus oxycarpa Schlecht and Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht. had the stronger inhibitory effect on mushroom phenoloxidase and insecticidal activity. On the basis of previous research conclusions that the same natural occurring compounds have the same inhibitory properties to different sources of phenoloxidase. Different components in the foliage of two species of Elaeagnus angustifolia L. with the stronger inhibitory effect on mushroom phenoloxidase and insecticidal activity will be separated and purified using a reverse phase C-18 preparative column and high-speed countercurrent chromatography. The molecular structures of the compound monomers will be identified via NMR, FTIR and LC-MS spectral analyses. The biological activities of the compounds will be determined with the assay model of effect on larval toxicity and inhibitory activity of phenoloxidase in Plutella xylstella L. and Apocheima cinerarius. The research is to preliminarily explore the action mechanisms of the compounds from the leaves of Elaeagnus angustifolia L in Xinjiang on insect phenoloxidase. The purpose of this study is to seek the lead compounds of new type insect phenoloxidase inhibitors and promote the research of the structure-activity relationship of the derivative series and the molecular modification of enzyme inhibitors.

酚氧化酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能，筛选昆虫酚氧化酶抑制剂对开发以酚氧化酶为靶标的新型“害虫控制剂”具有重要的现实意义。新疆沙枣植物资源十分丰富，但是有关沙枣叶具有农药活性的研究尚未见报道。前期研究发现从两种沙枣叶中提取的抑制蘑菇酚氧化酶活性较高的物质同时具有杀虫活性。依据前人的研究结论“相同的生物源化合物（酶抑制剂）对不同来源的酚氧化酶的抑制特性具有统一性”，本项目拟采用反相C-18制备型色谱柱和高速逆流色谱技术分离沙枣叶中同时具有抑制酚氧化酶活性和杀虫活性的成分，通过核磁共振、傅立叶变换红外光谱和液相色谱-串联质谱分析技术测定化合物的结构。以对小菜蛾和春尺蠖幼虫的毒力及酚氧化酶活性的影响为指标，测定化合物的生物学活性，并开展化合物对昆虫酚氧化酶的抑制机理研究。以寻找新型昆虫酚氧化酶抑制剂的先导化合物，促进以此模板合成的系列物的构效关系（QSAR）和酶抑制剂分子改造的研究。

小菜蛾（Plutella xylostella （L.））是我国所有省市农业生产中的重要害虫，春尺蠖( Apochemia cinerarius Ersch)除危害果树外，对新疆塔里木河中下游濒危植物胡杨亦构成较为严重的危害。多酚氧化酶（Phenoloxidse，PO）不仅参与昆虫黑色素形成、角质硬化和伤口愈合，还作为非自身识别系统在对寄生物的防御反应中发挥作用。由于不同昆虫体内的多酚氧化酶表现不同的酶学特性，因此深入研究不同昆虫来源多酚氧化酶的生物学特性，筛选对酚氧化酶具有高效抑制作用的化合物是开发以PO为靶标的新型农药的有效途径。目前，国内外学者对沙枣叶的化学成分及其生物活性的研究报道较少。本项目采用40%饱和度硫酸铵沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤等步骤，分别对小菜蛾幼虫和春尺蠖幼虫多酚氧化酶进行提取纯化，并研究它们的酶学性质。结果表明：部分纯化的小菜蛾多酚氧化酶的比酶活为344.8 U/mg，是粗酶液的4.27倍；部分纯化的春尺蠖多酚氧化酶的比酶活为617.21 U/mg，是粗酶液的 6.06倍。酶学性质的测定结果表明：小菜蛾幼虫酚氧化酶最适pH值为6.0；最适温度为30 ℃；当温度升至55 ℃以上时，随着保温时间的延长，酶活力下降较为迅速，至60 ℃时保温15 min，酶趋于失活。通过米氏常数（Km）值的测定可知小菜蛾幼虫酚氧化酶与底物邻苯二酚的亲和力要大于与底物L-多巴的亲和力。春尺蠖幼虫酚氧化酶在pH 6.5、25 ℃时活性最高；当温度高于45 ℃时，随着保温时间的延长，酶活力下降明显。春尺蠖酚氧化酶对焦性没食子酸、邻苯二酚和L-多巴的Km值分别为6.45、1.11和1.3 mmol /L。采用昆虫酚氧化酶活性跟踪法结合各种现代色谱技术从新疆沙枣树叶中分离得到六个化合物，利用质谱和核磁共振技术鉴定了其中两个化合物（化合物6、7）的分子结构。酚氧化酶活性的抑制率测定结果表明，化合物7对小菜蛾幼虫酚氧化酶活性具有显著的抑制作用，0.125 mg/mL的化合物7作用后酶的剩余活力为52.1%。沙枣叶中分离的化合物6、7均对春尺蠖幼虫酚氧化酶具有较好的抑制活性，经0.125 mg/mL的化合物6作用后，春尺蠖酚氧化酶的剩余活力为46.9%，经0.125 mg/mL的化合物7作用，该酶的剩余活力为50.9%。