果实致病真菌中NADPH氧化酶复合物组成成分的分离鉴定及功能研究

由病原真菌引起的果实采后腐烂造成了巨大的经济损失。探明病原真菌的致病机理对研制能有效防治果实采后病害的新技术具有重要指导意义。病原真菌细胞膜上的NADPH氧化酶复合物对于病菌的致病性至关重要，但有关NADPH氧化酶复合物的作用机制，包括蛋白质组成成分以及受复合物调控的下游基因并不清楚。本项目将以果实重要致病真菌灰霉菌（Botrytis cinerea）为研究材料，通过串联亲和纯化结合质谱技术分离并鉴定NADPH氧化酶复合物亚基，利用免疫共沉淀研究各蛋白质组分之间的相互作用，并通过基因突变研究复合物各组分与病原真菌致病力的关系。同时，本项目拟采取差异蛋白质组学研究受NADPH氧化酶复合物调控的下游基因以及它们的功能。通过以上研究，我们将揭示NADPH氧化酶复合物调控病原真菌致病力的分子网络，为研制果实采后病害的有效控制技术和新型杀菌物质提供新的依据。

病原真菌感染是导致果实采后腐烂的主要因素，探明病原真菌的致病机理对于研制果实采后病害的防治技术具有重要的指导意义。病原真菌细胞膜上的NADPH氧化酶复合物对于致病力至关重要，但有关NADPH氧化酶复合物的作用机制并不清楚。本项目以果实采后重要致病真菌灰霉菌（Botrytis cinerea）为研究材料，克隆了NADPH氧化酶复合物的调控亚基bcnoxR和催化亚基bcnoxA，并构建了bcnoxR和bcnoxA的缺失突变体。表型观察表明，bcnoxR及bcnoxA突变体生长速率减慢，致病力降低。为了研究NADPH氧化酶复合物的作用机制，在bcnoxR中开展了差异蛋白质组学分析，共鉴定到48个差异表达的蛋白质。选取其中两个差异蛋白6-phosphogluconate dehydrogenase (GPD)和actin进行了功能分析。GPD和actin基因突变以后灰霉菌的致病力均显著下降，表明这两个基因参与了NADPH氧化酶复合物对病原菌致病力的调控。actin与细胞形态构成和细胞内物质运输等密切相关。为了研究actin调节病原菌致病力的分子机制，通过定量蛋白质组学研究了actin突变以后对灰霉菌细胞外水解酶的影响。结果表明，actin突变将降低灰霉菌中多种细胞外水解酶的分泌。对其中11种水解酶进行的突变体构建及功能分析显示，两个水解酶（gpi-anchored cell wall beta endoglucanase protein, beta-d-glucan cellobiohydrolase b protein）的编码基因突变以后灰霉菌致病力显著下降，说明actin通过调控灰霉菌水解酶的分泌影响致病力。此外，通过转录组学研究了bcnoxR突变体中发生差异表达的基因，鉴定到243个差异表达基因，这些基因参与了物质代谢、膜转运、信号转导、细胞抗逆等。通过以上研究，我们部分揭示了NADPH氧化酶复合物调控病原真菌致病力的分子网络，为研制果实采后病害的有效技术提供了依据。