基于靶向PD-L1的多糖纳米颗粒负载肿瘤干细胞抗原的树突状细胞疫苗研究

Cancer stem cells (CSC), which are the important targets for cancer immunotherapy, play an important role in the tumorigenesis and metastasis as well as recurrence. Dendritic cell (DC) vaccine is one of the most effective strategies for tumor immunotherapy in the world. CSC for DC vaccination can induce targeting CSC immune therapy for preventing tumorigenesis, metastasis and tumor recurrence. In previous study, polysaccharide nanogels have enhanced the uptake of antigen and specific immune response for improving vaccine efficacy. However, the regulatory T cells were activated when DC interacted with T by PD-L1/PD-1 signaling pathway, which induced DC vaccine dysfunction remains to be the major obstacle for developing effective vaccines. In the current project, we propose PD-L1-targeted polysaccharide nanoparticles as CSC antigen vector, which will deliver CSC antigen into DC, and acquired CSC of DC vaccine. The modified target molecules can be combined with PD-L1 on DC, which enhance uptake antigen of DC and overcoming tumor immunosupression by blocking PD-1/PD-L1 signaling pathways of DC between T cells. Therefore, this project is expected to be a new DC vaccine strategy for tumor biological therapy.

肿瘤干细胞（CSC）在肿瘤进程、转移和复发等多个过程中扮演重要角色,是肿瘤免疫治疗的重要靶点。树突状细胞（DC）疫苗是当今世界肿瘤细胞免疫治疗中最有效的措施之一。基于DC的CSC疫苗可诱导抗CSC的免疫应答，从根本上解决肿瘤发展、转移和复发等问题。前期研究证明多糖纳米凝胶可稳定负载抗原，提高DC对抗原的摄取，增强特异性细胞免疫应答。然而在DC疫苗治疗中，由肿瘤患者单核细胞诱导分化的DC，其表面PD-L1与T细胞PD-1相互作用，活化调节性T细胞，产生免疫抑制严重影响治疗效果。本项目拟在多糖纳米凝胶上修饰PD-L1抗体分子，并负载CSC抗原致敏DC，获得靶向CSC的DC疫苗。通过修饰的靶分子与DC上PD-L1结合，提高DC对CSC抗原的摄取效率；同时阻断DC与T细胞之间PD-1/PD-L1信号通路，减少调节性T细胞产生，提高机体特异性抗CSC免疫应答，为肿瘤生物治疗提供新策略。

基于DC疫苗的免疫治疗是一种新的肿瘤治疗策略，但由于传统抗原的免疫原性差和入胞效率低的等问题，基于肿瘤细胞裂解物（TCLs）的DC疫苗的抗肿瘤效果仍不理想。本项目利用纳米多糖构建多功能抗原载体系统，通过负载肿瘤抗原或肿瘤干细胞抗原构建新型DC疫苗，进而诱导特异性抗肿瘤或抗肿瘤干细胞免疫应答，从根本上解决肿瘤发展、转移和复发等问题。此外，研究中我们发现利用肿瘤细胞相关外泌体直接构建自抗原载体系统，能构建更简单、安全、有效的DC疫苗。.方法：首先以葡聚糖为骨架，采用腙键在多糖骨架上修饰上疏水性小分子，其次在多糖羟基上修饰上乙二胺，最后在部分乙二胺分子上修饰上PD-L1抗体靶向分子，构建多功能抗原载体(NP)。其次，通过超速离心法从肿瘤细胞培养上清中提取肿瘤细胞相关外泌体（TAEs），构建自抗原载体。然后分别评价多功能抗原载体和自抗原载体对DCs功能及抗原呈递的作用。同时利用荷瘤小鼠进一步评价基于多功能抗原载体或自抗原载体构建的DC疫苗的治疗效果。此外，为了验证基于自抗原载体构建的DC疫苗免疫调控机制，我们应用免疫荧光和流式细胞术检测了肿瘤组织的凋亡、肿瘤浸润CD8+ T细胞和Tregs的表达。.结果：我们的数据表明，多功能抗原载体或自抗原载体均能上调DCs表面标记CD83和CD80的表达,促进IL-12分泌，有效地促进DC成熟和增强MHC交叉呈递，这直接导致显著的肿瘤特异性免疫应答。此外，基于多功能抗原载体或自抗原载体构建的DC疫苗能有效抑制肿瘤生长，延长小鼠生存率。更重要的是，自抗原载体降低了DC上PD-L1的表达，从而导致体外Tregs表达下调。此外，体内实验显示基于自抗原载体构建的DC疫苗上调肿瘤浸润的CD8+ T细胞以及降低TDLNs和脾脏中Tregs的产生。.结论：基于纳米材料制备的多功能抗原载体或肿瘤细胞相关外泌体制备自抗原载体均可通过增强DC成熟介导的高效免疫应答。同时基于自抗原载体构建的DC疫苗通过上调肿瘤浸润的CD8+ T细胞和减少肿瘤微环境中的Tregs，有效延长小鼠生存期，为构建新型高效的DC疫苗提高新的策略。