BAM8的N端剪切与BR信号共同调节植物生长的分子机制

The BZR1 family transcription factors are key regulators of Brassinosteroid (BR) responsive gene expression. In addition, the genomes of vascular plants also encode two conserved β-amylases, BAM7 and BAM8, that contain a BZR1 DNA-binding domain at the N terminus. Research studies showed that BAM7and BAM8 regulate the development of leaves and petioles, probably by competing for the same targets with BZR1 while their β-amylase domain is speculated to respond to a sugar signal. However, the mechanism of regulating BAM7and BAM8 activity is still not clear. Using immunoblot and mass spectrum, we detected N-terminal cleavage in BAM8. Here we propose to study (1) whether and how BAM8 cleavage is regulated by BR or sugar, and (2) whether and how cleavage between the BZR1 and β-amylase domains alter the activity of BAM8 in regulating BR target gene expression. We will analyze BAM8 cleavage in plants grown under different levels of BR and sugars. We will determine the precise cleavage site in BAM8 protein using mass spectrometry, and then will overexpress the N terminal and C terminal parts separately in transgenic plants and analyze the developmental and BR-response phenotypes. Our study will uncover new mechanisms of regulating BR responses, potentially by sugar or carbohydrate signals.

BZR1家族转录因子是油菜素内酯（BR）响应的重要调控因子。此外，植物中还有两个N端含有BZR1相似的DNA结合结构域而C端为β-淀粉水解酶的蛋白，BAM7/8。研究显示，BAM7/ 8可能与BZR1竞争共同靶基因而抑制BR响应，从而调节了植物叶片和叶柄的发育。BAM7/8的β-淀粉水解酶域可能结合糖信号，但调控BAM7/8活性的信号和机制还不清楚。我的研究发现BAM8存在N端剪切。本项目将阐明调节BAM8的N端剪切的信号和机制及其对植物生长的调控作用。我计划利用质谱方法找到BAM8的N端剪切位点；分析不同BR和糖条件下植物中BAM8的剪切水平；分别过表达其N端和C端剪切产物，分析转基因植物表型以及对BR处理的响应，推断BAM8的N端剪切对植物生长和BR响应的调节作用。最终期望通过质谱分析找到参与调节BAM8剪切的蛋白因子，从而阐明BAM8通过N端剪切调节BR响应和植物生长发育的分子机制。

糖类物质不仅是一种能量来源和结构物质，还能作为信号分子调节植物的生长发育。糖信号的HXK1、SnRK1和TOR三个主要响应因子与各种环境因子和激素信号相互作用来调节植物的生长发育过。除此以外，植物中有一类进化上非常保守的BZR1-BAMs蛋白（BAM7和BAM8），其N端具有BZR1-DNA结合结构域，C端有葡聚糖水解结构域，可能介导营养代谢与油菜素甾醇类激素（Brassinosteroid, BR）的相互作用。BMA7和BAM8能够作为转录因子结合与BZR1相似的顺式作用元件。根据BAM8蛋白的结构特点及其转录因子特性，BAM8蛋白可能感知植物体内糖类等营养信号与BR信号共同调节植物生长发育，然而其中的分子机制还不清楚。本课题通过免疫印迹实验发现植物除了存在全长BAM8蛋白以外，还存在N端缺失的BAM8蛋白。我们通过免疫沉淀得到BAM8蛋白的两条条带，分别是全长BAM8和缺失N端的BAM8截短蛋白。通过15N稳定同位素标记结合质谱方法，我们比较并分析了两种BAM8蛋白的分布比例，从而鉴定到BAM8的第180-195，196-211氨基酸处发生了两处N端剪切。为了探索BAM8 及其N端的功能，我们构建了相应的转基因植物，并观察各个转基因植物的生长表型。结果显示， BAM8的N端过表达促进了植物根的伸长，并且调节了植物叶片发育。为了进一步揭示BAM8 的N端剪切在植物体内发挥作用的分子机制，我们还对BAM8转基因植物进行了各种激素的处理，最终发现BR可以抑制BAM8的N端剪切。本研究揭示了BAM8蛋白调节植物生长发育的重要机制，对于全面解析BAM8受到BR调节，进而调节植物生长发育的分子机制具有重要的理论意义。