PI3K/AKT/mTOR 信号通路过度激活导致淋巴管畸形的机制研究

Lymphatic Malformation (LM) are common congenital symptomatic vascular anomalies.The mechanistic of PIK3CA mutations related to LM remain elusive. To gain insight into the cause of LM，we hypothesized: 1.The expression of PIK3CA mutations lead to activating PI3K/AKT/mTOR path. 2. AKT dephosphorylation, and decrease its ability to recruit LECs which lead to the formation of LM. 3. RAPA targets mTOR, inhibits PI3K/AKT/mTOR signal path, promotes LM to degrade. To test above hypothesis in vivo and ex vivo, this research is designed. We construct mice model with LM-LECs harvested through immuno-magnetic beads selection, and observe the development of Lymphatic system and migration of LM-LECs, as well as analyzed the expression level of Prox-1、VEGF-C、LYVE-1 and AKT through fluorescence microscope、Western blotting、ELISA、RT-PCR and in situ after RAPA administation. This research is significant to explore the pathogenesis of LM, and can provide molecular target for treatment of LM.

淋巴管畸形（LM）是常见的先天性脉管异常类疾病。研究表明，PIK3CA基因突变与LM的发生密切相关，但具体机制不明。本研究提出假说：①PIK3CA突变导致下游PI3K/AKT/mTOR信号通路过度激活。②过度激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路，同时AKT磷酸化。使其介导淋巴管内皮细胞迁移、增殖障碍，从而导致LM发生。③雷帕霉素，通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR，致PI3K/AKT/mTOR信号通路失活，AKT去磷酸化，促使LM消退。为验证此假说，本课题拟通过磁珠分选获得具有异常增殖、分裂能力的淋巴管内皮细胞（LM-LECs），构建LM动物模型，荧光显微镜观察裸鼠发育过程中淋巴管系统的发育及LM-LECs迁移及增殖情况。应用免疫组织化学、ELISA、RT-PCR和免疫印迹等技术，检测RAPA作用前后Prox-1、VEGF-C、LYVE-1及AKT的基因和蛋白的表达及磷酸化水平的变化。

淋巴管畸形（LM）是常见的先天性脉管异常类疾病。前期研究发现，PIK3CA基因突变与LM的发生密切相关，但具体机制不明。本研究的主要内容包括，（1）微囊型LM标本，磁珠分选方法分离LM-LECs，鉴别其分化、增殖能力，Prox-1+细胞混悬于基质胶，建立裸鼠模型。与Prox-1-细胞对照，观察淋巴管系统的发育情况，研究相关信号分子的表达水平及部位。（2）应用PI3K/AKT/mTOR蛋白激酶抑制剂GS-1101/Idelalisib抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，观察淋巴管系统发育，并检测AKT磷酸化水平，研究LM的发生与PI3K/AKT/mTOR信号通路及AKT磷酸化程度的关系。（3）体外培养人LM-LECs，研究PIK3CA和PI3K/AKT/mTOR信号通路与Prox-1、VEGF-C、LYVE-1的表达变化及AKT磷酸化水平之间的关系。（4）RAPA注射于LM-LECs裸鼠模型，观察荧光标记的LM-LECs的迁移及增殖。不同时间段取材，测定组织中Prox-1、VEGF-C、LYVE-1及PI3K/AKT/mTOR的表达变化,找到RAPA的作用靶点。（5）不同浓度的RAPA药物对体外培养的LM-LECs作用48h后，检测Prox-1、VEGF-C、LYVE-1的基因和蛋白等的变化，明确RAPA作用PI3K/AKT/mTOR信号通路靶点。重要结果：（1）构建了LM裸鼠模型。（2）明确了PI3K/AKT/mTOR 信号通路过度激活导致LM发病。（3）明确了RAPA作用PI3K/AKT/mTOR信号通路靶点，为应用RAPA治疗LM提供依据。关键数据：免疫荧光鉴定淋巴管畸形样品中淋巴管内皮细胞，细胞膜标记物LYVE-1和CD31高表达。转录组测序分析结果表明大量基因上调和下调。上调基因，主要包括：多种补体相关基因显著上调。下调基因，主要包括：呼吸链复合体、角蛋白显著下调。明确PI3K/AKT/mTOR在LM发病中的关键作用，探索 LM 的发病机制，寻找新的治疗药物靶点或确定最佳治疗方案，为更多的LM患者提高治疗效果提供科学依据。