烧伤脓毒症T淋巴细胞GATA-3对膜联蛋白1表达调控的研究

A decrease in Th1/Th2 ratio is one of the major characteristics of immunosuppression in post-burn sepsis, transcriptor GATA-3 and membrane adhesive protein Annexin-1 play an important role in the Th1/Th2 shift. It is reported that GATA-3 mRNA levels in sepsis patients were decreased, and our previous study found Annexin-1 of peripheral lymphocytes from scald injury and burn sepsis were down-regulated and two consensus GATA3-binding sites in the Annexin-1 promoter. Therefore, we speculate Annexin-1 expression is regulated by GATA-3 in sepsis condition, and induce immunosuppression. The project will investigate the change of Th1/Th2 ratio, and GATA-3 and Annexin-1 expressions in sepsis after burns , and further use gene transcription, siRNA interference, electrophorectic mobility-shift assay (EMSA), chromatin immunoprecipitation (ChIP), luciferase reporter gene analysis, etc, to study the regulation mechanisms of transcriptor GATA-3 on protein Annexin-1 in lymphocytes. It is hoped that by elucidating the regulation mechanisms of GATA-3 and ANXA-1 on the shift of T-cell subsets in post-burn sepsis, we can find out the important pathogenetic factors in immunodysfunction in post-burn sepsis, and provide new aspects in the prevention of post-burn sepsis.

淋巴细胞Th1/Th2下降是烧伤脓毒症免疫抑制的主要表现，转录因子GATA-3和膜连蛋白1 (ANXA1)在其中起重要作用。文献报道脓毒症患者淋巴细胞GATA-3转录活性下降，申请者前期研究证实严重烧伤和烧伤脓毒症淋巴细胞ANXA1表达下调，同时发现在ANXA1的启动子区存在与GATA-3结合的序列。因此推测脓毒症状态下GATA-3可能调控ANXA1的表达，从而导致免疫抑制。本研究将系统地动态观察烧伤脓毒症T淋巴细胞亚群及其GATA-3、ANXA1表达变化，并采用基因转染和siRNA干扰技术以及凝胶滞留实验、染色质免疫共沉淀 、荧光素酶报道基因分析等手段，深入探讨淋巴细胞GATA-3对ANXA1的调控机制，可望进一步阐明GATA-3、ANXA1对烧伤脓毒症T淋巴细胞亚群变化的影响及其机制，探讨烧伤脓毒症免疫功能紊乱发病机制中的关键性分子，为防治烧伤脓毒症提供新的思路和策略。

Th1/Th2比值下调是脓毒症后免疫抑制的重要特征，膜连蛋白A1（ANXA1）和转录因子GATA-3在T细胞的分化中起重要作用。但是,它们在脓毒症的变化，两者之间的关系，以及在调节Th1/Th2比值中作用，尚不十分清楚。本研究动物实验部分，系统地观察到烫伤组Th1/Th2伤后24h下降，48h和72h有所回升，烧伤脓毒症T淋巴细胞亚群Th1/Th2比值持续下降，与对照组比较具有统计学意义（P＜0.05）；Th1和Th2细胞中ANXA1、GATA-3 mRNA和蛋白表达在伤后24h、48h、72h持续下调,与对照组比较具有统计学意义（P<0.05）；通过Pearson相关性分析外周血淋巴细胞ANXA1与GATA-3 mRNA表达的相关性，具有统计学意义，相关系数0.862。体外试验部分，采用免疫荧光技术发现GATA-3和ANXA1共表达在T细胞的胞浆和胞核内；通过基因转染技术上调T细胞ANXA1的表达能够促进IFNγ分泌和降低IL-4生成，使Th1/Th2比值上调，同时GATA-3表达量下调和T-bet表达量上调；而沉默T细胞中ANXA1则抑制IFNγ分泌和促进IL-4的生成，使Th1/Th2比值下调，并观察到GATA-3表达量上调和T-bet表达量下调；进一步研究证实ANXA1通过FPRL-1的下游通路ERK和PKB/Akt磷酸化，从而调节GATA-3表达；并通过荧光素酶报道基因分析，发现GATA-3能够结合ANXA1启动子区域，从而调节其表达。这些结果表明烧伤脓毒症中Th1/Th2比值下降，T细胞中GATA-3和ANXA1表达降低，且它们表达变化具有相关性；ANXA1可通过ERK和PKB/AKT通路磷酸化调节GATA-3表达，促进Th0向Th1分化；而GATA-3可以直接结合ANXA1启动子下调ANXA1表达。该研究较深入地探讨了烧伤后免疫功能紊乱的发病机理，分析了GATA-3和ANXA1在烧伤脓毒症发病机制中的重要作用及相互关系,为有效防治脓毒症、寻找药物新靶点提供了可靠的研究基础,对临床防治烧伤脓毒症具有重要的理论意义。