miR-134/LIN28A介导NF-κB信号通路研究肝纤维化机制及狗肝菜多糖（DCP）干预

Research group found that Dicliptera chinensis polysaccharides(DCP) had a great hepatoprotective and anti-fibrotic effect. The expression of miR-134 decreased, but the level of LIN28、NF-κB and downstream target genes TNF-α and IL-6 increased significantly, and DCP could regulate above indexes to anti-HF in rats with hepatic fibrosis(HF).NF-κB, which can be transcribed by LIN28A or miRNA, runs through the inflammatory response of liver. LIN28A interacts with miRNA.Therefore, there is likely to be an interactive relationship between miRNA-134 and LIN28A, which participate in HF by regulating NF-κB pathway.For this purpose, the current study apply siRNA, lentiviral vector, luciferase reporter gene assay, immunoprecipitation, miR-134-/-、 LIN28A-/- and NF-κB-/- knocked out mice et al to demonstrate whether miRNA-134 and LIN28A are new targets for prevention and treatment of HF and interact, and whether or how they control NF-κB pathway, and meanwhile to reveal whether DCP counteracts HF via miR-134/LIN28A - NF-κB pathway and provide new targets and potential drugs for prevention and treatment of HF.

课题组前期研究证实DCP具有显著保肝和抗HF作用，在HF大鼠中发现，miR-134表达下降，而LIN28、NF-κB及下游基因TNF-α、IL-6等大量表达，DCP可调控以上指标改善HF。NF-κB是肝脏炎症反应的中心环节，LIN28A和miRNA 均可介导NF-κB调控肝脏炎症，且LIN28A与miRNA存在交互关系。因此，推测miRNA-134和LIN28A可能存在交互作用，并介导 NF-κB通路调控HF进程。为此，本研究通过体内外实验，应用siRNA、慢病毒载体、荧光素酶报告基因、免疫共沉淀及miR-134-/-、LIN28A-/-和NF-κB-/-基因敲除小鼠等方法，明确miR-134与LIN28A是否为防治HF的新靶标及二者的交互关系，以及二者能否、如何调控NF-κB通路，同时揭示DCP是否通过miR-134/LIN28A介导NF-κB通路抗HF，为防治HF提供新靶标和潜在药物。

本项目旨在研究狗肝菜多糖（DCP）是否作用于miR-134介导的MAPK、NF-κB和LIN28A信号通路，寻找潜在的缓解肝纤维化（HF）的新方法。我们使用2,4-二甲基亚硝胺（DMN）和TGF-β1分别诱导大鼠和HSC-T6细胞建立HF体内外模型。肉眼观察取材大鼠肝脏，模型组肝脏呈暗红色和灰白色相间，表面粗糙，质地较硬且边缘变厚；DCP给药组肝脏病变程度较模型组均有改善。肝脏切片经HE、MASSON染色观察，模型组大鼠肝小叶结构被破坏，肝细胞排列分布紊乱，出现大量蓝色胶原纤维沉积，被沉积的胶原纤维分割成大小不等的假小叶，出现大量炎性细胞浸润和肝细胞坏死；与模型组相比，DCP给药组受损的肝小叶结构减轻，亦有不同程度的胶原纤维沉积，炎性细胞浸润减少。免疫组化结果发现模型组大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA表达较对照组增加，而DCP给药组肝组织中TGF-β1、α-SMA表达较模型组明显降低。RT-PCR结果显示在模型组中miR-134的表达显著上调，而DCP给药组中的表达均有不同程度的降低。通过检测ALT、AST、ALP、TBIL、HA、LN、PC-III、IV-C、TGF-β1和α-SMA的活性或含量，证实DCP对肝纤维具有确切药效。WesternBolt结果显示，DCP可抑制α-SMA、TGF-β1、LIN28A、NF-κBp65、MMP9、COX-2、iNOS、ERK、JNK和p38等蛋白表达，表明其可干预MAPK、NF-κB和LIN28A信号通路的激活。通过ELISA、RT-PCR检测发现下游炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低，表明DCP可减轻炎症反应。总之，DCP通过抑制miR-134的表达，进一步抑制MAPK、NF-κB和LIN28A信号通路的激活从而缓解HF。.此外我们制备了免疫性肝损伤和非酒精脂肪肝模型，研究DCP对此两种病理模型的保护作用和作用机制。结果显示DCP能显著抑制Fas/FasL配体系统及凋亡相关蛋白和mRNA的表达，从而减少细胞凋亡，达到治疗免疫性肝损伤的效果。DCP对非酒精脂肪肝的保护作用可通过调控TLR-4/NF-κB炎症通路和AMPK/Nrf2氧化应激通路调节糖脂代谢和氧化应激，改善NAFLD。综上研究成果发表研究性论文10篇，其中6篇SCI和4篇北大核心期刊；获授权发明专利1件。