禽β-防御素在鸭组织中分布及其生物学作用的研究

禽抗菌肽属β-防御素类，在禽类防御系统中发挥重要作用。已从鸡、火鸡、驼鸟、企鹅等禽类体内分离到约30种禽β-防御素基因。但至今为止，未见有关鸭β-防御素类方面的研究报道。本项目根据已发现的禽β-防御素基因序列，设计特异性引物，采用RT-PCR法从鸭体内组织中克隆3～5种新的β-防御素基因，并检测它们在鸭体内组织器官的分布规律。在此基础上，构建上述基因原核表达载体，在体外高效表达鸭β-防御素重组蛋白，并检测其生物学活性与理化特性。然后，分别以严重危害禽类健康及其产品安全的细菌：大肠杆菌与沙门氏菌等；病毒：鸭病毒性肝炎与鸭瘟为研究模型，研究上述鸭β-防御素重组蛋白在鸭体内外的抗菌与抗病毒活性。并通过饲养试验，结合免疫接种，分别以口服和注射两种途径研究上述鸭β-防御素重组蛋白对肉鸭生产性能、肠道微生态区系和免疫功能的作用。以期探讨鸭β-防御素重组蛋白作为新的饲料添加剂服务于养殖业的可行性。

全世界每年有数千人死于动物源病原微生物引起的传染病。其中，由于误食受细菌或病毒污染的禽肉、蛋产品为其主要原因。畜禽产品的安全性越来越受到消费者关注。其中包括畜产品的生产和加工等过程的无污染。使用安全无污染、无残留、无毒副作用的饲料添加剂是解决这一问题的重要途径。抗菌肽是生物体内产生的一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，是机体先天性免疫系统的重要组成部分，在抵抗外源病原体的入侵方面发挥重要作用。抗菌肽广泛分布于动物、植物和昆虫等体内。至今为止，未见有关于抗菌肽的毒副作用、残留、致细菌耐药性等方面的报道。因此，抗菌肽在养殖业方面具有广阔的应用前景。本研究从鸭体内组织中扩增到11个鸭AvBD基因，这11个基因分别为鸭AvBD1－7、AvBD9、AvBD10、AvBD12和AvBD16。其cDNA大小依次为198，195，182，168, 201，204，204，204，207，198，155。分别编码65，64，60,56,66，67，67,67，67，65, 50个氨基酸残基。将这11个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1，转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达。将表达的蛋白进行纯化，同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的11条多肽。抗菌活性实验结果表明，重组和合成鸭AvBD蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用。在高盐浓度下，这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低。此外，这些蛋白溶血活性极低。体外抗鸭肝炎病毒作用结果表明，与阳性对照（病毒组）相比，这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间，表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用。经鸭肝炎病毒诱导后，除鸭AvBD基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调。此外，在攻毒后的各个时间点，也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调。同时，本试验结果还显示，这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关。上述结果揭示，这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控。