基于钙离子通道探讨广痛消水提物肠吸收液及其有效成分对肛门内括约肌的解痉机制

Pain is the most common postoperative complications of patients with anorectal disease, which mainly results from the spasticity of anal sphincter. Guang Tong Xiao aqueous extract can reduce the rest pressure of anal canal to release the postoperative pain. Based on the previous research, the intestinal absorption solution of Guang Tong Xiao aqueous extract(IASGTX), which contains tetrahydropalmatine (THP) and paeoniflorin (Pae) as effective components, can release the spasticity of anal sphincter of rats, due to the inhibited calcium channels. In this paper, the spasmolysis of IASGTX & effective components is firstly investigated through isolated rat rectal circular smooth muscles model. Then, the effect of THP and Pae on the concentration of free calcium, the activity of Na-K pump and calcium pump as well as the gene expression and electrophysiology of L-type calcium channels in rat anal sphincter smooth muscle cells are observed, respectively. Moreover, to illuminate the principle of the spasmolysis of Guang Tong Xiao aqueous extract, the relationship between IASGTX & effective components and calcium channels is researched. This research provides the theoretical fundament and experiment basis for the treatment of postoperative anal pain in Traditional Chinese Medicine(TCM), which makes a contribution to the modernization of TCM and the manufacture of new drug.

疼痛是肛门疾病术后最常见的并发症，而肛门内括约肌的痉挛被认为是引起术后肛门疼痛的一个主要原因。广痛消水提物能够降低术后肛管静息压，缓解术后疼痛。前期研究发现广痛消水提物肠吸收液能够缓解大鼠肛门内括约肌痉挛，且肠吸收液中含有延胡索乙素、芍药苷等有效成分，其作用机制可能与阻断钙离子通道有关。本研究拟通过大鼠离体直肠环平滑肌模型来评价广痛消水提物肠吸收液及其有效成分的解痉作用，并观察延胡索乙素、芍药苷对大鼠肛门内括约肌平滑肌细胞内游离钙离子浓度的影响、对钠钾泵及钙泵活性的影响、对L型钙离子通道基因表达及电生理的影响，探索广痛消水提物肠吸收液及其有效成分与钙离子通道的关系，以期进一步阐明广痛消水提物的解痉机制，为中医药治疗肛门术后疼痛提供理论依据和实验支持，对中药现代化进程及中药新药研制，具有十分重要的理论意义和实用价值。

钙离子在平滑肌收缩中发挥着关键作用，广痛消水提物能够降低肛管静息压，缓解疼痛，其作用机制可能与钙离子通道有关。建立非翻转肠囊法，采用小鼠离体直肠环灌流技术，采用累积加样法研究肠吸收液及其有效成延胡索乙素（THP）、芍药苷（Pae）对小鼠离体直肠环张力的影响，发现广痛消水提物肠吸收液具有显著的直肠环舒张活性，并存在量-效关系和时-效关系；THP和Pae能够缓解由氯化钾及氯化乙酰胆碱引起的小鼠直肠环的痉挛，其作用机制可能是阻断钙离子电压门控通道，并抑制细胞内钙的释放及细胞外钙的内流。应用特异性钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞,激光共聚焦显微镜检测游离钙离子浓度，结果显示THP和Pae对大鼠肛门内括约肌平滑肌细胞内钙离子浓度有一定影响。采用RT-PCR和Western方法，检测广痛消有效成分对小鼠肛门平滑肌细胞钙离子通道mRNA和蛋白表达的影响，THP和Pae混合加药有增加钙离子通道mRNA含量和蛋白表达的趋势。采用全自动膜片钳技术和离子通道阅读器（ICR8000），检测大鼠肛门内括约肌平滑肌细胞受THP、Pae干预前后，离子通道活性的变化，结果表明Pae对钙离子通道活性抑制偏弱，但对钾离子通道活性有显著抑制作用，提示其作用机制可能是通过钾离子通道进而影响钙离子电压门控通道。采用CCK-8方法检测THP和Pae对大鼠结肠平滑肌细胞的活力影响，并且建立了LPS致炎症体外模型，研究发现THP和Pae具有抗炎作用。建立UPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析广痛消水提物在大鼠胆汁中的代谢产物，初步阐明了广痛消水提物的体内代谢特征。本课题通过小鼠离体直肠环平滑肌模型、体外细胞离子通道活性研究技术、分子生物学技术初步阐述广痛消水提物肠吸收液及其有效成分的解痉作用及其机制。并对其在体内的药效物质代谢进行了初步研究，为进一步研究药物作用机制提供了研究基础。