microRNA-71在多房棘球绦虫干细胞中的生物学功能研究

The lack of knowledge on Echinococcus multilocularis neoblast biology severely limits its applications as a model.miRNAs are a type of small gene expression-regulating RNA, involved in many biological processes including stem cell metabolism and differentiation. Recent studies have suggested that miR-71 is closely involved in platyhelminth neoblast physiology and functions. With combined use of in situ hybridization and flow cytometry, E. multilocularis will be used to investigate the cellular expression features of miR-71 in this study. In addition, neoblast apoptosis, mitotic level and ability to produce differentiated cells will be determined after down-regulation of miR-71. Similarly, the expression of the molecules and the activity of the pathways closely associated with the homeostasis maintenance, proliferation and differentiation of the neoblasts will be investigated. Together with these results will be used to scientifically evaluate the alterations of miR-71-/- neoblast physiology and functions.These results will illustrate the relationship between miR-71 and platyhelminth neoblast functions and have implications in deep understanding of molecular basis of neoblast functions. Moreover, they will also provide theoretical clues for studies of miR-71 functional paradigms in the neoblasts.

由于缺乏对多房棘球绦虫干细胞（neoblast）生物学的认识，大大限制了它作为模式生物的应用。miRNAs是一类调控基因表达的小RNA，参与干细胞代谢、分化等多种生物学过程。近期研究表明，miR-71可能在扁形动物neoblast中发挥一定的作用。本研究以多房棘球绦虫为研究对象，利用原位杂交、细胞流式等技术，重点分析miR-71的细胞表达特征，确定在下调miR-71表达水平后neoblast凋亡、有丝分裂的水平及产生分化细胞的能力，同时研究与neoblast自身平衡、分裂增殖和分化等密切相关分子的表达水平及信号通路的活性，科学评价miR-71-/-neoblast在自身平衡、分裂增殖和分化等方面的变化，初步揭示miR-71在扁形动物neoblast中的生物学功能。该研究对阐明neoblast生理功能的分子基础，有一定的科学意义，也为深入研究miR-71在干细胞中的作用模式提供理论支持。

随着体外培养体系的建立和全基因组的解析，多房棘球绦虫作为模式生物已用于干细胞生物学以及吸虫和其它绦虫的研究。然而，缺乏对多房棘球绦虫生物学的认识，特别是对其成体未分化细胞neoblasts生物功能的认识，严重影响多房棘球绦虫作为模式生物的广泛应用。已有研究表明，涡虫miR-71可能在neoblasts中呈特异性表达，并与其生物学功能密切相关，而emu-miR-71在多房棘球绦虫中发挥怎样的作用至今还没有报道。本研究首先建立了多房棘球蚴在实验动物中的传代；利用核酸杂交、RNA-seq、qPCR等技术，分析了emu-miR-71的分子进化以及在多房棘球蚴中的组织分布与表达特征，体内外验证了其靶标分子。结果表明，多房棘球蚴能在DBA/2小鼠中稳定传代。miR-71与miR-2b/c以簇的形式存在，且在扁形动物中非常保守。emu-miR-71在细胞凝集物（多房棘球蚴发育前期）、多房棘球蚴和激活的原头蚴中均表达，但在后者中的表达水平明显升高。在原头蚴中，emu-miR-71的表达水平因发育时期的不同存在明显差异：在无钩的原头蚴中表达水平非常高，而在有钩的原头蚴中表达水平较低，表明它可能在原头蚴发育中发挥作用。比较结果表明，emu-miR-71和neoblasts在原头蚴中的组织分布明显不同。另外，还发现emu-miR-71也存在于外泌体中。体内外研究结果均显示，emu-miR-71能够抑制在生长发育中发挥关键作用的NLK蛋白的表达水平。综上所述，emu-miR-71不在neoblasts中特异表达；它能作用于NLK，可能在原头蚴生长发育中发挥生物学功能。本研究揭示了emu-miR-71的进化和表达特征，为进一步深入研究它在原头蚴生长发育中的作用提供了线索。