多房棘球绦虫Argonaute蛋白新类群在小RNA诱导的沉默途径中的功能研究

Argonaute protein is a key component of small RNA-induced silencing complex. Cestodes and trematodes express 3~4 Argonaute proteins, 1 of which is grouped into the Ago subfamily and the rest grouped into a novel subfamily Cluster 1, suggesting the presence of other small RNA-induced gene regulation pathways in these species. This study will use Echinococcus multilocularis as a model and, using in situ hybridization, immune confocal microscopy, mass spectrometry and next-generation sequencing techniques, focus on investigation of expression and tissue features of 3 novel Argonautes. The differences in the components of small RNA-induced silencing complex and the small RNA-binding spectra of these 3 novel Argonaute proteins will be comparatively studied. Then the interactions of these Argonautes with small RNAs and other components of the silencing complex will be in vitro verified. Furthermore, the expression levels of small RNAs, other Argonautes and components of the silencing complex will be analyzed in cases of silencing or overexpressing of Argonaute, aiming to illumination of the functional relationship of these Argonautes. These results have implications in revealing of the complexity and diversity of small RNA-induced gene silencing system in cestodes and trematodes, and also provide scientific evidence to understand the functions of these novel Argonautes.

Argonaute蛋白是组成小RNA诱导的沉默复合体的重要成分。绦虫和吸虫表达3~4个Argonaute蛋白，其中1个为主要结合miRNA的Ago亚家族，其余的则属于新类群Cluster 1，提示它们可能存在除miRNA外的其它小RNA诱导的沉默途径。本研究以多房棘球绦虫为研究模型，通过核酸原位杂交、荧光共聚焦、质谱和新一代测序等方法，分析其表达的3个新类群蛋白的组织分布特征；对比研究3个新类群蛋白所形成的沉默复合体的组成差异，解析它们的小RNA结合谱；体外验证3个新类群蛋白与其它沉默复合体分子和小RNA的相互作用；在沉默或过表达1个新类群蛋白的情况下，确定其它2个新类群蛋白和沉默复合体分子的表达水平，以及小RNA及其靶标分子的丰度，阐明这些新类群蛋白功能上的互补关系。这对揭示绦虫和吸虫小RNA诱导的沉默体系的复杂性和多样性有一定的科学意义，也为认识这些新类群蛋白的生物学功能提供科学证据。

AGO蛋白是组成小RNA诱导沉默复合体的重要成分。多房棘球绦虫表达4种AGOs，其中1种为主要结合miRNA的Ago亚家族，其余的则属于一个新类群，但目前对其分子特征及生物学功能知之甚少。本研究首先建立了多房棘球绦虫的长爪沙鼠实验室保虫模型；应用现代先进生物学技术，确定了EMU-AGOs在RNA/蛋白质水平上的组织分布，解析了EMU-AGO的分泌性及胞外囊泡的生物学功能，系统研究了Dicer、Drosha等一些AGO功能相关蛋白的分子特征及进化，并初步分析了RISC复合体的组成成分。结果发现，无论在RNA还是蛋白质水平，EMU-AGOs在多房棘球绦虫原头蚴中都没有明显的组织分布特征，EMU-AGO1-3+细胞数量非常少，neoblast（H3(Ser10)+）细胞数量也非常少，存在H3(Ser10)+EMU-AGO3+细胞，却未发现H3(Ser10)+EMU-AGO2+细胞。多房棘球蚴胞外囊泡由负染的囊膜包裹，多呈球形，粒径为34–95 nm，带有433种蛋白质，如14-3-3、ENOLASE和具有免疫调节作用的囊壁蛋白TegP11等，但未发现AGO蛋白。除蛋白质外，多房棘球蚴胞外囊泡还包裹有18种不同的miRNAs，以及一类高丰度的苏氨酸tRNA来源的小RNA，它们并非由苏氨酸tRNA降解形成，更有可能是在某种机制下合成的功能性小RNA分子。全基因组分析发现，与其他绦虫/吸虫相比，多房棘球绦虫的AGO、Dicer和Exportin基因都可能发生了扩增，且三种Dicer蛋白即Dicer1、Dicer2和Ribonuclease Ⅲ在结构上存在明显差别。其中，在多房棘球绦虫Dicer2的RNase III结构域中，参与催化的关键氨基酸发生了缺失；并且，与经典的‘球-袋’结构相比，在棘球绦虫Dicer1的RNase III结构域中，参与连接‘球-袋’结构的关键氨基酸也发生了突变。以上研究结果表明，多房棘球绦虫的AGOs呈不同的时空表达，且与线虫的不同，它们并不能通过胞外囊泡的方式进行分泌。而且，AGOs及其功能相关蛋白Dicer和Exportin在功能上可能呈多样性，并存在一定的共进化关系。本研究结果将为阐明多房棘球绦虫可能表达多种不同的调节性小RNA提供理论基础，也为认识其小RNA诱导的沉默体系的复杂性和多样性，以及这些新类群蛋白的生物学功能提供科学证据。