CD40和骨桥蛋白特异性siRNA对MRL-Lpr狼疮小鼠治疗作用的实验研究

系统性红斑狼疮（ SLE）是一种多系统受累的自身免疫性疾病。骨桥蛋白能诱导B细胞多克隆化，使之产生过量免疫球蛋白，膜蛋白CD40在活动期SLE患者B淋巴细胞的表达增加，其水平与疾病活动度有关。.本课题针对CD40和OPN各设计一段siRNA，构建真核表达载体。将构建成功的重组体采用脂质体转染小鼠J774.1细胞株，RT-PCR检测CD40和OPN mRNA表达水平的变化；检测上清中细胞因子IL-1等；TUNEL检测J774.1细胞凋亡情况。同时将重组体注射MRL-Lpr狼疮鼠，ELISA检测细胞因子TNF-α等细胞因子；RT-PCR检测脾脏CD40 mRNA及肾脏OPN mRNA表达的变化水平；免疫单扩法检测IgS、C3、C4及CRP的变化；间接免疫荧光检测dsDNA。从而进一步观察两段siRNA对SLE的潜在治疗作用，为SLE的基因治疗提供试验依据。.本实验具有广阔的临床应用价值。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。pLL3.7载体是常用的慢病毒RNAi载体，因带有EGFP，发出绿色荧光，可以用作筛选标记。前期的研究结果显示：CD40和OPN的siRNA质粒载体采用脂质体转染小鼠巨噬细胞J774.1的效率很低，没法进行后续实验，因此，本研究该为构建CD40和OPN的siRNA慢病毒载体，以CD40其中一段siRNA（命名为pLL3.7-CD40-siRNA）做预实验，制备病毒并感染小鼠巨噬细胞J774.1，从而大大提高了J774.1细胞的感染效率，约为58.6%，实时荧光定量RT-PCR检测CD40的基因沉默效果，结果显示：pLL3.7-CD40-siRNA组CD40 mRNA的表达明显低于对照组和pLL3.7空载体组，差异有统计学意义(P<0. 05)。有研究发现CD40/ CD40L信号途径在系统性红斑狼疮（SLE）的发病中起关键作用，Carreño等也研究发现SLE患者较健康对照者高表达共刺激分子CD40。所以，采用siRNA技术降低CD40 mRNA的表达，减弱B细胞的免疫反应，从而可降低CD40/ CD40L信号途径在SLE中的作用。