野生燕山葡萄脱水素基因VyDHN1调控砧木葡萄抗寒功能的研究

The cultivated varieties from Vitis vinifera are susceptible to cold. So it is vital for researching and using the cold resistance gene to expand the cultural area and improve the quality in green development grape industry. Dehydrins belong to plant resistance relative proteins, which play an important role in plant resistance to low temperature stress. The cold-resistant dehydrin gene VyDHN1 from Vitis yeshanensis obtained in previous studies is adopted in the present research, the project of the research include: (1) to study the chaperone activity, subcellular localization and interacting protein of VyDHN1 at protein level; (2) to explore the expression patterns and feedback mechanism of VyDHN1 by transformed into tobacco; (3) to clarify the cold resistance of VyDHN1 by overexpressed or RNA interference expressed into the rootstocks grape; (4) to find out the influence of the transcription and translation of VyDHN1 in Vitis vinifera scion by micrografted into the transformed rootstocks. This study is expected to explain the mechanism of VyDHN1 regulated the cold stress resistance in rootstock grape and the influence of VyDHN1 in the grafting system. In doing so, it will contribute to improve hardy rootstock grape breeding and cultivation.

主栽葡萄品种抗寒性差，研究和利用抗寒基因扩大葡萄栽培范围、提高葡萄品质是葡萄产业健康发展的重要科学问题。脱水素是一类抗逆蛋白，在植物抵御低温胁迫中发挥重要的作用。本项目以前期研究获得的燕山葡萄抗寒脱水素基因VyDHN1为研究对象，研究内容包括：（1）在蛋白质水平研究VyDHN1的分子伴侣活性、亚细胞定位、互作的蛋白质；（2）通过转化烟草研究VyDHN1基因的调控与反馈机制；（3）研究过量和RNA干扰表达VyDHN1对砧木葡萄抗寒功能的影响；（4）通过微嫁接技术研究转VyDHN1砧木对接穗欧洲葡萄抗寒性的影响并探讨VyDHN1在接穗中的转录、表达情况。通过上述研究，以期明确VyDHN1调控砧木葡萄抗寒的分子机制和在嫁接体系中的作用，为转基因砧木葡萄抗寒的生产应用提供理论依据。

本项目首先研究燕山葡萄脱水素基因VyDHN1的蛋白功能及其互作蛋白，然后探讨proVyDHN1启动子的调控模式，最后揭示VyDHN1基因在砧木葡萄5BB的抗寒作用机理以及转基因砧木对接穗葡萄抗寒性的影响。研究发现，proVyDHN1启动子在植物中组成型表达，低温胁迫、盐胁迫、脱落酸（ABA）、水杨酸和茉莉酸甲酯处理能够显著提高proVyDHN1启动子活性。VyDHN1蛋白具有分子伴侣活性和抑菌性，且外源VyDHN1蛋白能提高烟草种子低温萌发率。正常情况下，VyDHN1蛋白定位于植物细胞的细胞膜和细胞质中；VyDHN1蛋白能与蔗糖非发酵相关激酶（SnRK1）和山梨醇脱氢酶（SDH）蛋白互作，定位于细胞核中；VyDHN1蛋白同样可以与COP9信号体复合体亚基5b（CSN5b）蛋白互作，定位于细胞膜、细胞质和细胞核中。在过表达VyDHN1::GFP砧木葡萄5BB微嫁接苗的根系以及少量嫁接结合部的形态学下端的部分愈伤组织中发现GFP荧光信号，接穗中均未检测到目的基因VyDHN1和标记基因GFP的转录和表达。过表达VyDHN1基因能够提高转基因烟草对ABA的敏感性；冷胁迫下，VyDHN1基因的过表达，能够降低植物糖类和淀粉合成代谢以及植物细胞生长发育，并促进糖酮等抗逆化合物的合成，进而显著提高转基因砧木葡萄5BB、烟草的抗寒性，通过与过表达VyDHN1的砧木葡萄5BB微嫁接也能够显著提高接穗欧洲葡萄的抗寒性。