激活环磷酸腺苷反应原件结合蛋白（CREB）降低耐药性颞叶癫痫大鼠脑组织GABAA受体表达的分子机制

Patients with pharmacoresistant epilepsy displayed significant decreased GABAA receptors in the focal brain tissues. However, the mechanisms underlying the decrease of the GABAA receptors are unclear. The cAMP response element binding protein(CREB) decreased remarkably in the brain of the epileptic rats and the patients with intractable epilepsy. It is speculated that consistent activation of the CREB in the focal brain tissues leads to the decreased expression of the GABAA receptors. Therefore, the antiepileptic drugs fail to control the epilepsy. The present study aims to explore the molecular mechanism underlying the decreased GABAA receptors in the brain of pharmacoresistant epileptic rats. We will firstly prepare the model of pharmacoresistant epileptic rats. And then, the techniques of gene modulation, signal pathway activation or blocking are used to modulate the CREB function. Subsequently, the expression of the GABAA receptors, the epileptic seizures and the amygdalae EEGs are to be observed. The IPSC、mIPS and the membrane excitability of the hippocapal neurons are to be recorded. The technique of chromatin immunoprecipitation is used to observe the combination of the CREB and the GABAA receptors. These studies might be helpful in demonstrating that if the CREB play important roles in decreasing the GABAA receptors of the pharmacoresistant epileptic rats. The present studies are expected to provide theoretical evidences for the pharmacoresistant mechanism of epilepsy, and probably to discover the new target of antiepileptic drugs in the treatment of pharmacoresistant epilepsy.

耐药性癫痫患者病灶区的脑组织伽马氨基丁酸A受体（GABAA）显著减少，但机制不清；癫痫大鼠及难治性癫痫患者脑组织cAMP反应原件结合蛋白(CREB)明显增加，CREB可在基因转录水平调节GABAA受体的表达，因此推测耐药性癫痫患者脑组织中由于持续性的CREB激活导致GABAA受体表达减少从使得抗癫痫药物失效。本研究的目的是探讨耐药性癫痫大鼠脑组织GABAA受体减少的分子机制。首先制作耐药性颞叶癫痫大鼠模型，然后通过基因调控、信号通路阻断及激活等方法调控CREB的功能，观察耐药性癫痫大鼠GABAA表达、癫痫发作及脑电变化，记录海马细胞IPSC、mIPS以及细胞膜兴奋性，并用染色质免疫沉淀技术观察CREB与GABAA受体基因结合情况，从而证实CREB是否在降低耐药性癫痫大鼠GABAA受体表达中发挥重要作用。本研究有望对癫痫耐药机制提供新的理论依据，同时可能发现新的药物治疗靶点。

本课题以耐药性癫痫大鼠模型、海马神经元为研究对象，通过基因调控、信号通路阻断及激活等方法调控CREB的功能，观察耐药性癫痫大鼠癫痫发作及脑电变化，采用新物体识别(NOR)测试和Morris水迷宫(MWM)任务评估癫痫大鼠的认知功能，运用电子显微镜观察大鼠海马的超微结构，采用Timm染色观察齿状回苔藓纤维发芽（MFS），采用盲法评定Timm评分。先后选用免疫组化、免疫荧光、实时定量聚合酶链反应( rt-PCR)和western blot检测环磷酸原件反应结合蛋白（CREB）、GABAA、GABAAR亚基等的表达。有以下主要发现：.1.本课题建立了一种制作癫痫模型的新方法，首次在药物抵抗性癫痫的杏仁核点燃模型中验证海马LFS能有效抑制耐药性癫痫大鼠的发作程度暨持续时间，同时抑制癫痫样脑电活动。首次发现其抗癫痫作用可能部分通过增加GABAAR α1、α5和γ2亚基来实现，既往未见报道。这一结果可能会促进一种新的治疗人类TLE患者的方法的发展。.2.本课题首次发现GABAA R α1亚基的升高可能与杏仁核点燃抗药癫痫大鼠ICER和BDNF的降低有关,这些结果提示ICRE和BDNF信号通路的相互作用可能为耐药性癫痫的治疗提供新的治疗靶点。.3.本研究首次采用新生大鼠神经干细胞(NSCs)诱导分化为GABAergic神经元, 观察移植对自发性复发性癫痫发作(SRS)的影响，并测定移植后海马GABA含量, 首次发现从神经干细胞分化的GABAergic神经元移植到海马可抑制匹罗果碱诱导的颞叶癫痫发作和癫痫样放电。.4.首次在低Mg2+海马神经元癫痫模型中，通过阻断或激活CREB功能，观察GABAA受体α1、γ2、δ亚基的变化, 最先发现PKC/CREB通路可负向调节低Mg2+癫痫模型海马神经元GABAA受体α1、γ2和δ亚基的表达。.5.调控正常大鼠海马神经元CREB对GABAAR α1、α5和γ2亚基产生负性调控作用，即上调CREB则GABAAR α1、α5和γ2亚基含量降低，干扰CREB则GABAAR α1、α5和γ2亚基则得到相反结果；在耐药性癫痫大鼠海马组织上调CREB则GABAAR α1、α5和γ2亚基减少，癫痫发作频率、发作时间增加；在耐药性癫痫大鼠海马组织干扰CREB则GABAAR α1、α5和γ2亚基表达增加，癫痫发作频率降低、发作时间缩短。