Gap1酶复合物调控副血链球菌粘附素Fap1糖基化的研究

Fap1是副血链球菌表面最重要的粘附素，在龋齿和牙周病等的发生中起重要作用。申请者前期研究发现Gap1与Gap3通过相互作用组成Gap1酶复合物调控Fap1的糖基化,最近的预实验又发现SecY2、Gap1、Gap2与Gap3的基因置换株均呈现相同的表型，提示Gap1酶复合物还包括SecY2和Gap2。本研究拟采用酵母双杂交与Co-IP等方法检测SecY2与Gap1以及Gap2与Gap1等蛋白质之间的相互作用，并向基因置换株转入相应的无相互作用结构域的表达质粒,分别使SecY2和Gap2从Gap1酶复合物解离，分析Gap1酶复合物的解离对Fap1糖基化及其相关表型（如长菌毛的形成力与细菌粘附力等）的影响。通过本研究，不仅可进一步明确Gap1酶复合物调控Fap1糖基化的机制，而且为抑制副血链球菌的粘附与致病提供科学依据。

Fap1,一种O-糖基化的糖蛋白，是副血链球菌最重要的粘附素致病因子,前期研究表明：Gap1与Gap3通过相互作用组成Gap1酶复合物调控Fap1的糖基化，缺失相互作用结构域的突变株以及Gap1与Gap3基因置换株均表达约470KD高分子量不成熟的Fap1，并导致细菌粘附力显著下降。在本研究中，我们首先采用基因同源重组技术对Gap2进行基因置换，并采用免疫印迹技术检测Fap1糖蛋白的表达，结果发现Gap1、Gap2和Gap3的基因置换株中Fap1糖蛋白呈现相同的表型。随后采用酵母双杂交技术与GST PULL-DOWN技术检测Gap1、Gap2和Gap3的相互作用，结果发现Gap1与Gap2以及Gap2与Gap3之间均存在相互作用，因此Gap1酶复合物中，除了Gap1和Gap3外，至少还包括Gap2。随后我们采用Co-IP实验也证实Gap1与Gap2的相互作用。在明确Gap1与Gap2的相互作用后，我们采用PCR致突变技术构建一系列的Gap1突变体，明确了其相互作用的结构域。随后我们将缺失相互作用结构域的表达载体转入Gap1的基因置换株，发现其并不能恢复成熟Fap1的表达，说明Gap1酶复合物的完整是Fap1成熟的重要保障。另外，Gap1酶复合物的解离将导致副血链球菌黏附能力下降、生物膜形成减少和长菌毛数量的显著减少，但是对小鼠龋齿的形成影响不大。