副血链球菌粘附素Fap1糖基化过程中糖基转移酶基因功能研究

许多疾病的发生都与细胞表面蛋白糖基化相关，糖基转移酶基因功能研究是揭示蛋白质糖基化的重要手段。副血链球菌粘附素Fap1是一种糖化的细胞表面蛋白，对人类最复杂的细菌生物膜牙菌斑形成非常重要。 Fap1第一步糖基化由Gtf1和Gtf2协同催化，但其后续的糖基化过程目前还不清楚。本项目以位于Fap1生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gly、nss、galT1和galT2为研究对象，构建单个或多个上述基因的阻断突变株来探讨Fap1糖基化过程及细菌生物膜形成和粘附能力的变化；结合Fap1在大肠杆菌中糖基化的模型系统来研究上述四个基因的糖基转移酶功能；利用体外糖基转移酶活性测定、特性研究以及基因定点突变来确定上述四种基因编码产物的糖基转移酶活性及活性位点。研究结果可进一步探明Fap1糖基化过程，为Fap1同源物糖基化分子机制提供有益的启示，丰富细菌蛋白质糖基化理论，并为预防和控制病原细菌提供理论依据。

细菌富丝氨酸糖蛋白Fap1及其同源物在细菌定殖和致病机制中扮演重要角色，其生物合成途径非常保守。Gtf1和Gtf2介导Fap1第一步糖基化，但Fap1后续的糖基化步骤目前还不清楚。本项目对参与Fap1后续糖基化过程相关的基因进行了研究。.1. gly、nss、galT1和galT2基因突变影响Fap1糖基化和细菌生物膜形成。DXD motif突变影响Gly和GalT2功能。利用大肠杆菌Fap1△RII糖基化模型系统检测出Nss介导Fap1△RII第二步糖基化，GalT1和GalT2介导Nss之后的Fap1△RII糖基化步骤，Gly介导Fap1△RII最后一步糖基化。糖基组分和糖链组成分析结果显示，Nss和GalT1可能是葡萄糖基转移酶，GalT2和Gly可能是鼠李糖基转移酶。.2. 对Nss功能进行了深入研究。体外糖基转移酶活性实验直接证实Nss催化底物为GlcNAc-rFap1，是一个不依赖于金属离子的葡萄糖基转移酶，将其命名为Gtf3。Gtf3蛋白C端序列（314-330 aa）对于Fap1糖基化和寡聚化非常重要。来源于链球菌的Gtf3同源物功能非常保守，显示Fap1及其同源物具有相似的糖基化分子机制。.3. 对GalT1功能进行了深入研究。GalT1催化底物为Glc-GlcNAc-rFap1，是一个依赖于金属离子的葡萄糖基转移酶。GalT1的N端DUF1792域在链球菌中功能非常保守，DXE motif突变明显降低DUF1792域催化活性。GalT1蛋白C-端序列可能与GalT1蛋白成熟化相关。.4. 糖基转移酶体外测定方法也成功验证了Gtf1和Gtf2的功能，该方法可适用于其它糖基转移酶活性测定。.5. 对gap1和gap3基因功能进行了探讨，结果显示gap1突变导致gap3基因不表达，Gap1具有分子伴侣功能，可保护 Gap3不被蛋白酶降解。Gap1和Gap3蛋白复合物能和SecA2相互作用。. 以上研究成果为Fap1同源物的糖基化分子机制研究提供了理论指导，并为研发新型抗菌药物提供了新的靶点。相关论文发表于Applied and Environmental Microbiology，Journal of Biological Chemistry，Journal of Bacteriology和Molecular Microbiology。