小分子化合物IWR1促进人胚胎干细胞自我更新的分子机制研究

Human embryonic stem cells (hESCs) are able to differentiate into any type of human cell and tissue. However, they can not be efficiently maintained in vitro. Recently, we found that inhibition of Wnt/β-catenin signaling can greatly promote hESC self-renewal with small molecular IWR1, whereas activation of this pathway will induce hESC differentiation. In order to investigate the molecular mechanism under the self-renewal-promoting effect of IWR1 and the relationship between IWR1 and β-catenin, we will first generate β-catenin-null hESCs using CRISPR/Cas9 to determine if β-catenin is necessary for IWR1 to maintain hESC identity. Then we will perform RNA sequencing, combined with gene gain- and loss-of-function techniques, to screen and identify the core transcriptional factors regulated by IWR1 implicated in promoting hESC self-renewal. Our project will provide an expanded understanding of the current regulatory network of hESC pluripotency, which will not only lay the foundation for the future applications of hESCs, but will also facilitate the development of new culture conditions for the derivation of ESCs from other species.

人胚胎干细胞（Human Embryonic Stem Cells, hESCs）可以分化成各种不同的组织和细胞，但在体外维持其未分化状态的条件比较苛刻。前期我们发现Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂IWR1可以有效地促进hESCs的自我更新，而激活此信号通路则会诱导分化。为了解析IWR1促进hESCs自我更新的功能与β-catenin的关系及其下游的分子机制，我们将首先运用基因编辑工具CRISPR/Cas9敲除β-catenin基因，以明确IWR1促进hESCs自我更新是否依赖β-catenin的存在；然后利用转录组测序技术筛选被IWR1影响的下游基因，通过基因表达的上调和干扰技术，最终鉴定出能够介导IWR1调控hESCs自我更新的下游关键因子。本课题国内外尚无报道，有望揭示调控hESCs多能性的新机制，深化目前人们对hESCs自我更新调控网络的认识，利于其基础和应用研究。

胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）分离自着床前的囊胚内细胞团，拥有无限的自我更新和多向分化的潜能，具有重大的社会和经济效益。但是与小鼠ESCs的体外培养条件相比，目前人ESCs (hESCs)在体外维持其自我更新的条件较为苛刻。前期我们发现Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂IWR1可以有效地促进hESCs维持其未分化的状态 （Nature Communications, 2013），因此解析IWR1的作用机制将有助于hESCs未来的基础和应用研究。基于此，我们进行了以下的研究：1）β-catenin除了调控基因表达外，还会介导细胞之间的连接，所以我们敲除了hESCs内的β-catenin基因，发现基因JUP会弥补β-catenin的功能，接着我们在β-catenin敲除的hESCs中下调JUP的表达，在IWR1存在的条件下，细胞失去了粘附，但仍处在未分化的状态，说明β-catenin调控的细胞连接对于IWR1促进hESCs的自我更新不是必需的；2）β-catenin入核后会与LEF1/TCF家族因子结合，从而诱导hESCs分化，而IWR1抑制β-catenin这一作用。LEF1/TCF家族因子包括LEF1, TCF1, TCF3和TCF4，接着我们分别过表达它们，发现TCF1会介导β-catenin诱导hESCs分化的功能。相反，干扰TCF1的表达会延缓hESCs分化；3）为了深入解析TCF1诱导干细胞分化的分子机制，我们利用转录组测序技术筛选TCF1调控的靶基因，发现TCF1会显著激活转录因子GATAT6的表达，从而导致hESCs的分化；4）hESCs与小鼠上胚层干细胞（Mouse epiblast stem cells, mEpiSCs）有相似的生物学特征，为了比较IWR1在两类细胞内的作用机制异同，利用转录组测序，我们发现IWR1主要通过诱导转录因子Foxd3的表达来促进mEpiSCs的自我更新，但是Foxd3并不能够促进hESCs未分化状态的维持。深入研究，我们目前初步发现ZEB2可能是IWR1促进hESCs自我更新的一个重要靶基因。本项目的研究成果不仅扩大了人们对干细胞自我更新调控网络的认识，也利于未来人们分离和维持其他物种的胚胎干细胞系，利于其转化应用。