鸡胚胎干细胞自我更新及体外重编程的分子机制研究

由于对鸡胚胎干细胞自我更新和全能性分子机制的研究甚少，目前真正具有生殖系转移能力的鸡胚胎干细胞系尚未建立。本项目在前期工作基础上，通过分析cPouV和cNanog基因在早期胚胎的表达模式及其在原代鸡胚盘细胞（BDCs）以及体外长期培养一已分化的BDCs的表达差异，并采用RNAi技术下调cPouV和cNanog基因，观察其对鸡胚胎干细胞增殖和分化的影响。在此基础上，设计诱导鸡BDCs重编程的基因组合，最终将已分化的BDCs体外重编程为鸡多能性干细胞。本项目的研究结果不仅可深入揭示鸡胚胎干细胞自我更新的分子机制，而且可望建立禽类诱导多能性干细胞技术，为今后开展鸡胚胎干细胞体外遗传修饰、转基因鸡抗病育种等方面的研究提供研究基础和试验依据，具有重要的科学意义和应用价值。

本项目主要做了以下工作：1.进一步优化了鸡胚胎干细胞分离、传代、冻存、复苏等技术以及离体培养体系。采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞，获得的完整胚盘率达75%-85%，克隆形成率为50%，该方法具有操作简便、节省时间、易得到完整的胚盘的优点；比较了挑克隆法、全消化法以及PBS+挑克隆法对CES细胞传代的影响，PBS+挑克隆法传代效果最好；以BRL-CM+饲养层+细胞因子作为培养体系，可将CES细胞传至25代。这些研究为胚胎干细胞体外长期培养和建系奠定了基础；2.采用地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）可将CES细胞诱导为脂肪细胞；3.阐明了鸡胚胎干细胞自我更新的分子机制。通过研究cNanog、cPouV和Sox2在鸡早期胚胎表达水平的动态变化和cPouV和cNanog基因在早期鸡胚发育过程中的表达定位，来证实三个基因在鸡早期胚胎发育中的作用。cNanog和cPouV的相对表达量变化呈现一致性，在孵育初期上调，孵育22h达到峰值，Sox2的相对表达量亦呈明显上调趋势；采用原位杂交的方法检测cPouV和cNanog在鸡早期胚胎中的表达模式。结果表明：在原条发生前，cPouV和cNanog基因均匀表达于明区，随着胚胎的发育，能够表达cPouV和cNanog基因的干细胞逐渐由中央明区向外周迁移；鸡胚胎干细胞全能性相关基因Nanog、PouV和Sox2在未分化干细胞中均能显著表达，随着干细胞分化时间的延长，三个基因的表达量呈现明显的下降趋势；采用RNAi技术下调cPouV和cNanog基因表达，观察鸡胚胎干细胞的增殖和分化能力的变化，结果显示：下调cNanog和cPouV基因表达后，cES细胞呈分化趋势，细胞增殖速度减慢，且cNanog的作用更强。.以上结果从在体和离体等不同方面证实了cNanog、cPouV和Sox2三个基因在鸡胚胎干细胞全能性维持和自我更新中起重要作用。