基于蛋白非酶糖基化的中药苦参干预糖尿病视网膜病变物质基础及机制研究

Based on our preliminary studies which indicate the Sophora flavescens Ait. could inhibit non-enzymatic protein glycation end product formation in vitro and reduce high glucose-induced vasodilation of zebrafish retinal vessel, and according to traditional Chinese medicine therapeutic method of “qingre and zaoshi” and modern medicine theory “non-enzymatic protein glycation”, this project will confirm the therapeutic effects of chemistry parts and chemical compositions through examine the influence of drugs on the morphology of zebrafish retinal vessel, suppressing AGES generated and cracking cross-linked structure; and will clarify material basis and action mechanism of “qingre and zaoshi” of Sophora flavescens Ait. through testing of drug-related protein and its receptor expression in rat retina by ELISA or RT-PCR and detecting of drug intervention model rats plasma metabonomics changes by NMR or LC/GC-MSn. The implement of this subject will provide the basis for comprehensive quality evaluation, new drug research and development of Sophora flavescent and have great scientific significant chinese medical pathogenesis and therapeutic methods of diabetic retinopathy.

糖尿病视网膜病变是最常见、最严重的糖尿病微血管并发症之一。在前期研究表明苦参具有抑制蛋白质非酶糖基化终末产物生成、减少高糖诱导的斑马鱼视网膜血管扩张作用的基础上，本项目依据中医糖尿病清热燥湿治法及现代医学非酶糖基化学说，考察药物对模型视网膜形态学影响、抑制AGEs生成及解离AGEs与胶原蛋白交联作用，确认药效部位及成分；采用ELISA、RT-PCR等方法考察药物对大鼠视网膜中相关蛋白及其受体表达的影响，采用NMR或LC/GC-MSn技术进行药物干预模型大鼠代谢组学检测，运用化学计量学手段处理图谱信息，比较干预前后代谢组学差异并寻找潜在的生物标志物，整合KEGG、Drugbank等数据库构建生物网络，从分子水平到系统整体阐明中药苦参清热燥湿干预糖尿病视网膜病变的物质基础及作用机制，从而为阐明苦参药效作用、全面评价苦参质量、研发新药提供依据；对阐明糖尿病视网膜病中医病机、治法具有重要科学意义。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是最常见、最严重的糖尿病(diabetes mellitus，DM)微血管并发症之一。在前期研究表明苦参具有抑制蛋白质非酶糖基化终末产物(AGEs)生成、减少高糖诱导的斑马鱼视网膜血管扩张作用的基础上，以苦参两类有效组分及单体化学成分为研究对象，采用AGEs体外反应系统、斑马鱼血管新生模型及链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠视网膜病变模型，从分子水平到系统整体阐明中药苦参干预糖尿病视网膜病变的物质基础及作用机制，主要包括如下几个方面：一、在前期基础上进一步深入完成了苦参中药化学研究，总计分离鉴定出化合物53个，其中新化合物2个；二、建立AGEs体外反应系统并结合虚拟筛选技术，分别对苦参有效部位及化学成分进行药效试验，结果表明苦参黄酮类成分可能在苦参发挥抑制体外AGEs 生成及抑制RAGE蛋白表达中起到主要作用；三、考察了苦参总黄酮对fli1-eGFP转基因斑马鱼模型血管生成抑制作用，发现其高、中剂量组均可明显抑制斑马鱼胚胎的血管生成；四、建立了链脲佐菌素结合高脂饲料诱导的大鼠视网膜病变模型，结果表明苦参总黄酮对STZ诱导的DM大鼠高血糖、体重下降的状况具有明显改善作用，可对抗DM大鼠血液流变学异常，能有效抵抗DM大鼠血脂异常。IHC、RT-PCR等结果表明苦参总黄酮可以通过调节RAGE基因及蛋白在视网膜中的表达，从而延缓、改善DR的病理改变；五、采用UPLC-MS/MS技术对药物干预前后大鼠的血浆样品进行检测，通过OPLS-DA进行多变量分析，筛选具有逆转趋势的代谢物作为潜在生物标志物。初步的代谢通路分析表明清热燥湿药苦参干预糖尿病视网膜病变的机制可能与调控氨基酸代谢、辅酶A及胆汁酸生物合成有关。项目的完成将为阐明苦参功效、全面评价苦参质量、研发新药提供依据。