高原鼠兔体细胞中精子特异性乳酸脱氢酶基因的表达对其低氧适应能力的作用及生理机制

Hypoxia is the most distinct climate character of Qinghai-Tibet Plateau. Plateau pika (Ochotona curzoniae) is a native rodent that inhabits in grassland at elevation above 3000m on Qinghai-Tibet Plateau.In evolution, plateau pika has obtained a serious mechanisms to adapt the hypoxic environment, and became a hypoxia tolerant mammal. In recent, our studying results indicated that Ldh-c is expressed not only in testis but also in somatic tissues of plateau pika. We suggested that,by the expression of Ldh-c in somatic tissues, plateau pika decreased dependence on oxygen and enhanced adaptation to the hypoxic environment by increaseing anaerobic glycolysis levels in its somatic tissues.Therefore,to further shed light on the specific adapting mechanisms of plateau pika to the hypoxic enviroment, in present project, we project to research the location of LDH-C4 in plateau pika somatic tissues by immunohistochemistry methods, the catalyzing enzymatically characteristcs of LDH-C4 by comparason with that of LDH-A4 and LDH-B4, and the antihypoxic and antifatigue effects of LDH-C4 on plateau pika as well as its physiological mechanisms by gene silencing methods.

低氧是青藏高原最鲜明的气候特征。高原鼠兔是一种青藏高原特有的啮齿动物，生活在海拔3 000m以上的高寒草原。高原鼠兔在长期进化过程中形成了一系列适应低氧环境的生理机制,对低氧具有很强的耐受性。我们最近的研究结果表明，Ldh-c基因不仅在高原鼠兔睾丸中表达，而且在其体细胞中表达。我们认为高原鼠兔体细胞中Ldh-c基因的表达，提高了组织无氧糖酵解的水平，减小了在低氧环境中对氧的依赖，增强了对低氧环境的适应能力。因此，本研究通过制备LDH-C亚基特异性抗体，应用免疫组织化学方法研究LDH-C4在高原鼠兔体细胞中定位；通过构建高原鼠兔Ldh-a，Ldh-b和Ldh-c基因的原核表达系统，分离纯化LDH-A4，LDH-B4 和LDH-C4，比较研究它们的酶促动力学特征；应用基因沉默技术研究LDH-C4对高原鼠兔抗缺氧和抗疲劳的作用及生理机制，进一步阐明高原鼠兔适应低氧环境的特殊生理机制。

高原鼠兔(Ochotona Curzoniae) 生活在海拔3,000 m以上的高寒草原，是一种青藏高原特有的非冬眠小型啮齿动物，高原鼠兔对低氧具有很强的耐受性，在长期进化过程中形成了一系列适应低氧环境的生理机制。LDH-C4又称精子特异性乳酸脱氢酶，先前的研究认为只在哺乳动物和鸟类的精子和睾丸中表达。我们前期的研究发现，Ldh-c基因在高原鼠兔体细胞中广泛表达。为研究LDH-C4在高原鼠兔低氧适应中发挥的作用，本研究通过构建高原鼠兔Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因的原核表达系统，分离纯化具有乳酸脱氢酶活性的LDH-A4、LDH-B4和LDH-C4，比较研究了它们的酶促动力学特征；应用LDH-C4特异性抑制剂和基因沉默的方法研究LDH-C4对高原鼠兔耐缺氧的作用及生理机制。研究结果表明，LDH-C4对丙酮酸的亲和力是对乳酸的90倍；LDH-C4对丙酮酸的亲和力分别是LDH-A4和LDH-B4的5倍和3倍；LDH-C4有利于催化丙酮酸向乳酸的转化。相比LDH-A4和LDH-B4，高原鼠兔LDH-C4的活力不易被高浓度的乳酸抑制。通过米氏方程得出，N-isopropyl oxamate是LDH-C4特异性抑制剂，在0.1mmol/L的浓度时能抑制70%的LDH-C4活力，而仅抑制5%左右的LDH-A4和LDH-B4。实验组高原鼠兔骨骼肌注射N-isopropyl oxamate后，游泳时间显著性下降，心、肝脏、脑、骨骼肌等组织中的乳酸脱氢酶活力 (Lactate dehydrogenase，LDH)、乳酸含量 (Lactic acid，LD) 和三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate，ATP) 水平均显著下降，抗耐疲劳能力显著降低。实验组高原鼠兔骨骼肌注射siRNA-Ldh-c腺病毒并饲养5天后，Ldh-c基因在mRNA和蛋白水平上均下降；组织中LDH总活力，LD和ATP含量、动物耐疲劳能力显著下降。Ldh-c基因在高原鼠兔体细胞中表达，有利于催化丙酮酸向乳酸的转化，加速无氧糖酵解过程，为组织生命活动提供部分ATP。高原鼠兔在此过程中减小了机体在低氧环境中对氧气的依赖，增强了对低氧环境的适应能力。