精子特异性乳酸脱氢酶基因在高原鼠兔体细胞中的表达及其生理功能

到目前为止的研究表明，Ldh-c 在哺乳动物的精子、卵母细胞和肿瘤细胞中表达，尚未见Ldh-c在哺乳动物体细胞中表达的报道，更不清楚LDH-C4在体细胞中的生理功能和作用机制。依据我们的前期研究基础和前人的研究结果，我们认为Ldh-c不仅在高原鼠兔精子中表达，而且在体细胞中也广泛表达；Ldh-c在高原鼠兔体细胞中广泛表达，可能有利于高原鼠兔在低氧环境中维持较高的能量代谢水平，有效消除在低氧环境中无氧酵解产生的过量乳酸，增强对低氧环境的适应能力。因此，本项目通过高原鼠兔体细胞中Ldh-c的表达水平与低氧之间的关系、LDH-C4的酶促动力学特征及其在高原鼠兔体细胞中的分布和活力、LDH-C4对乳酸代谢的作用及其对高原鼠兔耐缺氧和抗疲劳作用的研究，提供Ldh-c在哺乳动物体细胞中表达的可靠依据，阐明LDH-C4对高原鼠兔适应低氧环境的特殊生理功能和作用机制，丰富动物低氧适应机制理论。

为了证实LDH-C4是否在高原鼠兔体细胞中表达，通过分子克隆方法在高原鼠兔体细胞测定Ldh-a， Ldh-b，Ldh-c的序列；通过Real time PCR检测不同海拔高原鼠兔Ldh-a， Ldh-b，Ldh-c的表达量；通过原核表达系统分离纯化高原鼠兔LDH-C4，结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性，利用活性染色法确定LDH-C4在高原鼠兔体细胞乳酸脱氢酶同工酶谱中的位置。应用Western Blotting和免疫组织化学方法研究了LDHC在高原鼠兔体细胞和睾丸组织细胞中的分布。.结果表明：1. 高原鼠兔Ldh-a 基因全长1693bp，编码区长度为999bp，高原鼠兔Ldh-a的编码区与牛，人，大鼠，小鼠，兔子的同源性分别为87.89%，88.19%，85.69%，86.29%， 88.99%和88.49%；高原鼠兔Ldh-b基因全长1299bp编码区长度为1005bp，鼠兔Ldh-b的编码区序列与牛，人，大鼠，小鼠，猩猩的同源性分别为88.46%，90.15%，86.67%，86.47%，90.15%；Ldh-c在高原鼠兔心脏，肝脏，肺，肾脏，大脑中表达，编码区与睾丸中Ldh-c的序列完全一致，高原鼠兔Ldh-c与Ldh-a，Ldh-b的同源性分别为74%和68%。2. 随着海拔高度的增加，高原鼠兔心脏中Ldh-c的表达量下降差异不显著（P>0.05）、肝脏中Ldh-c的表达量极显著下降（P<0.01）、肺组织中Ldh-c的表达量下降差异不显著（P>0.05）、肾脏中Ldh-c表达量极显著减少（P<0.01）、大脑中Ldh-c表达量下降但差异不显著（P>0.05）、骨骼肌中Ldh-c表达量极显著减少（P<0.01）、睾丸中Ldh-c的表达量下降但差异不显著（P>0.05）3. 成功构建高原鼠兔LDHC原核表达系统，分离纯化得到了具有酶活性的高原鼠兔LDH-C4。4. 通过乳酸脱氢酶活性染色法，结合乳酸脱氢酶同工酶的热稳定性，证实在高原鼠兔体细胞乳酸同工酶谱中从阴极到阳极的第三条带是LDH-C4。5. 研究结果表明，在高原鼠兔体细胞中LDHC只在胞浆中表达，而在睾丸组织细胞中LDHC不仅在胞浆中表达而且在线粒体中表达。上述结果表明Ldh-c在高原鼠兔的体细胞中表达。