组织因子基因转染诱发动脉粥样硬化斑块易损和血栓形成的机制和模型的研究

急性冠脉综合征（ACS）是由于动脉粥样硬化（AS）斑块破裂、血栓形成所致，其机制的研究需依赖于一个理想的动物模型，然而，目前的动物模型均存在斑块破裂率低、血栓形成现象少见的缺陷。本研究将利用apoE基因敲除（apoE-/-）小鼠，通过高脂饮食和颈动脉套管的方法在其颈总动脉诱发AS斑块形成，分组后分别通过尾静脉注射方式体内转染腺病毒载体介导的小鼠组织因子(TF)基因、TF-shRNA基因和组织因子途径抑制物（TFPI）基因，检测各组动物血液TF、TFPI和某些凝血指标的浓度，阐述TF致血液高致栓性的作用机制；系统分析各组动物颈动脉斑块的形态，检测斑块内某些炎性指标的表达；并通过体外实验深入研究血管平滑肌细胞内TF过表达对PAR-2信号转导通路及其下游炎性细胞因子表达的影响，阐述TF的促炎作用机制。通过TF的促凝、促炎双重作用机制构建AS易损斑块血栓形成动物模型。

【背景】本研究拟解决以下科学问题:(1)增加斑块中TF表达，联合精神应激是否可诱发ApoE-/-小鼠发生斑块破裂并形成血栓?(2)TF是否通过PAR2介导对斑块稳定性产生影响。【研究内容】分为四部分实验:(1)过表达TF联合精神应激诱发ApoE-/-小鼠斑块急性事件发生，构建具有高斑块破裂并血栓形成率的动物模型;(2)体外观察TF对VSMC和巨噬细胞炎症因子基因表达的影响;(3)体外研究炎症因子对VSMC和巨噬细胞中TF表达的影响;(4)体内研究验证TF/FVIIa/PAR2途径对斑块稳定性的影响。【结果】(1)与精神应激组小鼠相比，TF过表达组斑块破裂率相近, 但血栓形成率(67% vs. 17%)、斑块内出血发生率(58% vs. 17%)和新生血管形成率(67% vs. 8%)均显著增加(均P<0.05)。与精神应激组相比，TF过表达组小鼠颈动脉斑块组织中共有6种炎性反应相关基因（Ccl2、Il4、Csf2、Lif、Itga2、Selplg）、1种细胞外基质（Lama1）和2种抗纤溶酶原激活物抑制（Serpine1和Serpinb2）表达明显上调（P<0.05)；(2)TF/FVIIa复合物能够剂量依赖性地增加VSMC及巨噬细胞中Ccl2、Il4、Csf2、Lif、Itga2和Selplg等基因mRNA表达水平。该作用不能被凝血酶抑制剂PPACK抑制；可被PAR2拮抗剂ENMD-1068 5uM和10uM所抑制，提示TF/FVIIa对上述基因表达的影响与凝血途径无关，主要是由受体PAR2介导;(3)TF/FVIIa刺激细胞后上清中MCP-1、IL-6等炎性因子含量显著升高，采用该上清液孵育细胞12小时后，细胞中TF表达水平显著上升，提示TF与炎症因子间存在互相促进作用;(4)与TF过表达组相比，TF过表达+PAR2拮抗剂组斑块组织中炎性反应相关基因mRNA表达水平、斑块内新生血管形成率和斑块内出血发生率均显著减低（P<0.05）。【科学意义】本研究通过过表达TF联合精神应激，成功构建具有高斑块破裂率和血栓形成的AS动物模型；首次提出在AS病变中，TF与炎症因子间相互促进，形成局部炎症和促凝活性的自我放大效应，加重斑块不稳定性；首次从动物体内证实TF能够通过PAR2介导促进斑块内新生血管形成，增加斑块内出血。抑制PAR2途径有可能成为稳定斑块的新靶点。