ATP依赖的Clp蛋白酶系统对结核分枝杆菌生长影响及机制研究

Clp蛋白酶在多种生物过程中发挥重要的作用，参与调节生物体蛋白质代谢，清除不可逆损伤蛋白质、对外应激耐受及维持内环境稳态等。结核分枝杆菌是人类重要病原菌，具有自身特殊的Clp蛋白酶系统，其核心成分含有双拷贝催化亚基（包括ClpP1和 ClpP2）。但是目前我们对Clp系统在结核分枝杆菌中的生物学作用还所知甚少。我们拟通过免疫金标技术，明确Clp系统各亚组份蛋白质的在结核分枝杆菌胞内定位；构建一系列的Clp缺陷菌株，研究在热休克、氧化应激、酸应激等因素下对结核分枝杆菌生物学性状的影响，初步探讨Clp系统在对外应激耐受中对结核分枝杆菌所起作用；并进一步采用二维凝胶电泳技术分析缺陷型和野生型菌株蛋白质表达的差异，分析每一Clp亚组分蛋白可能作用的蛋白底物，为将来研制以ClpP为靶点的抗结核菌药物提供理论依据。

Clp蛋白酶在多种生物过程中发挥重要的作用，参与调节生物体蛋白质代谢，清除不可逆损伤蛋白质、对外应激耐受及维持内环境稳态等。结核分枝杆菌是人类重要病原菌，具有自身特殊的Clp蛋白酶系统，其核心部分含有双拷贝催化亚基（包括ClpP1和 ClpP2）。但是目前我们对Clp系统在结核菌中的生物学作用还所知甚少。.我们用构建好的pBudCE4.1-up-down质粒，转入BCG中，利用同源重组的原理对clpP1和clpP2等基因进行敲除。虽然我们多次将重组质粒经过电转细菌后，细菌均不能生长，因此我们无法取得clpP1和clpP2的突变株。后来我们采用Yael Shenkerman等在文献中介绍的在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除高效同源重组系统，也没有得到clpP1、clpP2基因敲除株。后来我们通过比较基因组学方法，从多个层面上推断出clpP1、clpP2为结核杆菌的必需基因，必需基因对于细菌的生长必不可少，因此敲除这些基因后会引起细菌的死亡，从而无法通过实验同源重组的方式得到致死突变菌株。必需基因在生物体具有重要的意义，它们的翻译产物有可能成为潜在的抗生素的靶标。. 我们观察了它们在各种应激试验条件下的表达变化，我们重组表达、纯化了ClpP1、ClpP2、ClpC2蛋白，评价了它们的生物学特性，制备了它们的多克隆抗体，分析它们蛋白质亚细胞定位，评价了它们的过表达对细菌生长影响，ClpP1、ClpP2等蛋白的多克隆抗体良好特异性及抗原反应性，在结核病血清学快速诊断方面具有较好的应用前景。利用生物信息学方法对结核分枝杆菌Clp蛋白亚基进行理化性质的预测及相似性的比较，为Clp蛋白亚基的结构与功能研究提供预测和帮助。.这些观察表明Clp蛋白酶在结核分枝杆菌中充当一个不寻常的和基本的作用，不但可以作为抗生素的一个理想的靶标，也可能是一个理想的诊断靶标。