新疆雪莲SikCDPK1基因参与非生物逆境应答的功能和调控机制研究

It is significant to improve plant stress resistance by exploring and utilizing the stress resistance genes of adversity resources. Calcium-dependent protein kinase (CDPK) plays important roles in response to various abiotic stresses in plants, as the essential calcium sensors and calcium responder. We previously cloned a CDPK homologous gene SiKCDPK1 from Sasussured involucrata Kar.et Kir by RT-PCR. Overexpression of SiKCDPK1 in tobacco can improve stress tolerance to low temperature, drought and high salinity. Bioinformatics analysis revealed that the SiKCDPK1 protein contains only 2 EF hand calcium binding regions, which is different from most CDPK in other plant species. On this basis, we will explore the sensitivity of SikCDPK1 kinase to Ca2+ by studying the effect of EF hand on the kinase activity and Ca2+ binding, and analyze function and regulation mechanism of the SikCDPK1 gene involved in abiotic stress response by systemic research on the expression characteristics of SikCDPK1, and function of the promoter, and response of homozygous transgenic lines to abiotic stress. Our research will have a guiding significance for enriching the role of CDPK in the abiotic stress signal transduction, insight into the molecular mechanism of Sasussured involucrata Kar.et Kir involved in stress response and improving plant stress resistance.

发掘和利用逆境资源中的抗逆基因，对提高植物的抗逆性意义重大。钙依赖蛋白激酶（CDPK）作为植物细胞钙信号转导的主要感受器和效应器，在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。我们前期利用RT-PCR技术，从优异抗逆资源雪莲中克隆得到钙依赖蛋白激酶基因SikCDPK1，转基因烟草植株能明显提高对低温、干旱和高盐的抗性，生物信息学分析发现SikCDPK1蛋白结构中只含有2个EF手型钙结合区，与植物大多数CDPK不同。在此基础上，本项目拟通过EF手型结构对激酶活性和Ca2+结合性的影响研究，探讨SikCDPK1激酶对Ca2+的敏感性；通过对SikCDPK1基因的表达特征、启动子的功能验证和转基因纯合株系对非生物胁迫的响应等研究，解析SikCDPK1基因参与非生物逆境应答的功能和调控机制。研究结果对于丰富CDPK在抗逆信号转导中的作用，洞悉新疆雪莲响应逆境的分子机制和改良植物抗逆性具有指导意义。

抗逆基因的发掘和利用对提高植物的抗逆性意义重大。CDPK在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。本项目以SikCDPK1为研究对象，开展了以下四方面研究（1）通过SikCDPK1基因表达模式和亚细胞定位研究，明确了SikCDPK1基因在根、茎、叶、种子中的表达情况，发现SikCDPK1基因表达无明显组织特异性，探明了SikCDPK1基因响应GA3、SA、ABA、CaCl2、H2O2的诱导，对干旱胁迫和高盐、低温胁迫响应模式不同，明确了SikCDPK1基因是核定位基因。（2）通过EF手型结构对SikCDPK1激酶活性和Ca2+结合性影响的研究，探讨了SikCDPK1激酶对Ca2+的敏感性。发现EF手型结构缺失影响SIKCDPK1蛋白的表达，SIKCDPK1蛋白激酶是Ca2+依赖性的，受到nm级别Ca2+浓度的激发；将SikCDPK1基因EF-hand基序位置的碱基定点突变，发现突变蛋白空间构象发生改变，电泳迁移率发生变化，与Ca2+结合性减弱。（3）通过对转SikCDPK1基因植物研究，发现在干旱、盐和低温胁迫下，SikCDPK1基因可通过积累渗透调节物质、减少活性氧累积、维持细胞膜稳定性和调节下游应激基因NtDREB1A、NtRD29A、NtAP2、NtERD1和NtRD21A的表达变化，作为正向调控因子来提高植物的耐逆能力。（4）通过对SikCDPK1基因的启动子研究，发现ProSikCDPK1上存在高等植物启动子序列必需的核心元件，还具有多个与植物激素和逆境胁迫等相关的顺式作用元件；全长序列启动活性最强，能够被干旱、低温和盐胁迫诱导，启动活性中心主要位于起始密码子ATG上游≥480位核苷酸区间，表达量的增强还需要≥821位核苷酸上游的序列；ProSikCDPK1表达有明显的组织特异性，瞬时表达发现其活性次于35S，转基因烟草发现RD29A启动子驱动的转基因烟草抗逆性强于35S启动子驱动的转基因烟草。上述研究结果为解析SikCDPK1基因参与非生物逆境应答的功能和调控机制，丰富CDPK在抗逆信号转导中的作用，洞悉新疆雪莲响应逆境的分子机制和改良植物抗逆性奠定了理论基础。