非生物逆境应答转录因子对百合抗寒关键基因分子调控机制研究

Lily is an important commodity flower, is also widely used in the garden. Abiotic stress of low temperature affects not only the lily commodity production, and its landscape application. So to evaluate cold hardiness of wild lily specific cold resistance gene resources and mining, to plore the response mechanism and regulation of adversity in low temperature, which provides the theoretical foundation for application of lily genetic improvement and cultivation. Involved in regulation of transcription factor of plant low temperature stress response in the low temperature response lily network to play the role of a molecular switch, this study cold wild tiger lily lily (Lilium lancifolium) as the research object, analysis of the transcriptome sequencing data mining cold resistance genes and the response mechanism and regulation of low temperature stress. For RNA - seq Dan gene series low temperature stress analysis, achieve low temperature response transcription factor; Gateway technology was used to construct the volume low temperature response Dan missing key transcription factor promoter, the promoter regions of cis element function analysis; Is obtained by bait expression vector to construct and yeast transformation, key transcription factors regulating downstream gene; Chromatin were immune technology is used to determine the low temperature response key transcription factors and regulating downstream gene interactions. Finally reveals lily abiotic stress response mechanism and regulation of low temperature stress.

百合是重要的商品花卉，在园林中也广泛应用。非生物逆境低温不仅影响百合商品生产，而且制约其园林应用。所以评价抗寒野生百合特异资源并挖掘抗寒基因，探究低温逆境的应答机制与调控，为百合遗传改良和栽培应用提供理论基础。参与调控植物低温胁迫应答的转录因子在百合低温应答网络中起着分子开关的作用，本研究以抗寒野生百合卷丹（Lilium lancifolium）为研究对象，对转录组测序数据分析挖掘抗寒基因并进行低温逆境的应答机制与调控研究。对RNA-seq卷丹低温胁迫基因进行系列分析，获得低温应答转录因子；采用 Gateway 技术构建卷丹低温应答关键转录因子启动子缺失体，对启动子区域顺式元件功能分析；通过诱饵表达载体构建和酵母转化，得到关键转录因子下游调控基因；利用染色质共免疫技术确定低温应答关键转录因子和下游调控基因的相互作用。最终揭示百合非生物胁迫低温逆境的应答机制与调控。

在重分析卷丹低温处理（4℃ Cold Treat, CT）转录组（CK 0 h, CT 2 h, 16 h）差异表达基因的基础上构建了基因共表达网络，挖掘得到了 4 个显著富集于各种非生物胁迫响应的基因模块以及其中可能起关键作用的来自 MYB、NAC、ZFHD 家族的 3 个转录因子基因。分离克隆了上述 3 个转录因子基因的基因全长，命名为 LlMYB3、LlNAC2、LlZFHD4。亚细胞定位和转录激活活性分析发现，3 个基因编码蛋白均定位于细胞核且具有转录激活活性。组织特异性和不同胁迫条件下表达模式分析发现，3 个基因在卷丹鳞茎和花瓣中的表达量较高，并均能被低温、干旱、盐胁迫以及 ABA 处理诱导表达上调。从形态、生理生化和分子水平对过表达 LlMYB3、LlNAC2、LlZFHD4 转基因拟南芥分析发现，LlMYB3 和 LlNAC2 基因能有效增强转基因株系对低温、干旱及盐胁迫的耐受性，但也会导致转基因拟南芥对 ABA 的敏感性增强；LlZFHD4 基因也能一定程度上增强了转基因株系的抗寒性和抗旱性；3 个基因均能提高转基因株系的渗透调节能力，并能诱导转基因株系中一些胁迫相关功能基因表达上调。分离克隆了 3 个基因的启动子区域，顺式作用元件预测发现 3 个基因的启动子区域存在多个非生物胁迫响应相关元件及激素响应相关元件，包括 CRT/DRE、MYBRS、E-box、W-box、LTRE、ABRE 和 GARE-motif 等。在 LlMYB3 启动子驱动下的 GUS 基因在转基因拟南芥叶脉中特异性表达；而 LlNAC2 启动子能在低温、盐胁迫以及 ABA 处理后高效启动 GUS 基因的表达，使转基因拟南芥的 GUS 酶活性显著增强。分离克隆了卷丹低温应答转录因子 LlDREB1 基因，通过酵母单杂交分析发现，LlDREB1 转录因子能识别并结合 LlMYB3、LlNAC2、LlZFHD4 启动子区域的 CRT/DRE 元件；利用双分子荧光互补技术分析发现，LlDREB1 和 LlNAC2、LlNAC2 和 LlZFHD4 转录因子间还存在蛋白互作，LlMYB3 转录因子能与 LlCHS 的启动子片段互作，是 LlCHS 的上游调控因子。