游动放线菌A56在高渗培养条件下的代谢调节机制及麦芽糖转运特征研究

Acarbose, a pseudotetrasaccharide, is clinically and widely used in the treatment of type II diabetes mellitus. On the basis of the previous investigation on the industrial acarbose fermentation by Actinoplanes sp. A56, it was observed that the high concentrations of total sugar and osmolality (420-480 mOsm/kg) obtained by feeding maltose could highly improve the acarbose productivity. However, to date, little information is available on the metabolic reguration mechanism concerning the high-osmolality culture condition. Furthermore, as a direct precursor for acarbose biosynthesis, the transport and uptake characterization of maltose is still ambiguous. Based on this fact, this project firstly aims to illuminate the metabolic reguration mechanism under the high-osmolality stress, through investigating the effects of various osmolality concnetrations on the basal and biosyntheic metabolism pathway involved in Actinoplanes sp. A56. Nextly, this project will focus on the "carbophore" cycle, which particularly consists in acarbose-producing strain and mediates the transport and uptake of carbon sources. In this step, to explore the transport and uptake characterization of maltose caused by the high-osmolality stress, the enzyme kinetics and crystal structures of maltose-transport enzymes (acarviosyl-transferase, amylomaltase and maltose-transporting protein ) are determined and analyzed in the case of various osmolality concnetrations. In a word, the project aims to elucidate the mechanism why the high-osmolality culture condition can stimulate acarbose biosynthesis, which will further provide theoretic and technical supprot for a higher acarbose yield by Actinoplanes sp. A56 fermentation.

阿卡波糖系用于Ⅱ型糖尿病治疗的假性四糖物质。本课题组先期对自行筛选到的阿卡波糖产生菌游动放线菌A56进行发酵研究时发现，通过补加麦芽糖以维持发酵过程的高糖、高渗（420-480 mOsm/kg）条件能显著提高阿卡波糖产率。但是对于菌体在高渗条件下的代谢调节机制，尤其是麦芽糖作为阿卡波糖的直接前体物，其转运和利用特征尚不清晰。为此，本项目首先通过分析渗透压浓度的改变对菌体中心代谢和产物合成途径所产生的连锁变化，阐释菌体在高渗胁迫下的代谢调控机制；并以阿卡波糖产生菌独有的碳源转运系统"carbophore"循环为研究对象，详细考察不同渗透压浓度对参与麦芽糖转运过程的酶（蛋白）系（阿卡维基转移酶、麦芽糖转葡糖基酶、麦芽糖转运蛋白）的反应动力学及空间构象变化的影响，揭示游动放线菌A56在高渗胁迫下的麦芽糖转运和利用特征。本研究旨在阐释高渗胁迫促阿卡波糖合成的作用机理，以期为其发酵高产提供理论指导。

游动放线菌A56发酵过程借助补加麦芽糖所维持的高糖、高渗（420-480 mOsm/kg）条件能显著提高阿卡波糖产率，然而对于菌体在高渗条件下的代谢调节机制，尤其是麦芽糖作为阿卡波糖的直接前体物，其转运和利用特征尚不清晰。为此，本项目对游动放线菌A56在高渗胁迫下的菌体代谢调节机制以及麦芽糖跨膜转运与利用特征进行了研究：. （1）阐释了高渗胁迫下的菌体生理响应及代谢调节规律：菌体发酵过程的生化代谢参数及胞内代谢组学差异结果表明，与低渗条件（250-300 mOsm/kg）相比，高渗条件（450-500 mOsm/kg）会显著降低中心代谢途径的关键酶酶活并对菌体生长产生负作用，但是会显著提高阿卡波糖合成途径关键酶的酶活力，从而促进了阿卡波糖的合成；同时，菌体在高渗条件下会促进海藻糖的累积及脂肪酸的合成，从而应激高渗胁迫下的不利条件。. （2）阐明了不同渗透压下的麦芽糖转运特征：与低渗透压浓度相比，一定渗透压（450-500 mOsm/kg）不仅会对“Carbophore”循环系统中的关键酶（阿卡维基转移酶、麦芽糖转葡糖基酶）酶活力产生激活效益，而且有助于提高麦芽糖转运蛋白的麦芽糖结合效率，以此促进麦芽糖向胞内转运和积累，最终为阿卡波糖的合成提高足量的前体物质——麦芽糖。. （3） 探索到了不同渗透压下的阿卡维基转移酶构象变化特征：氨基酸序列分析和圆二色谱仪扫描的研究结果表明，阿卡维基转移酶酶蛋白为典型的α/β型蛋白结构，其中α-螺旋:β-折叠: β-转角:无规则卷曲=18.2:57.6:12.3:11.9，其分子量为76 kDa，并含有724个氨基酸；进一步研究发现，渗透压的升高会显著降低阿卡维基转移酶α-螺旋比例并提高β-折叠比例，其中450-500 mOsm/kg渗透压下的β-折叠比例高达63.2%，而β-折叠与麦芽糖结合位点密切相关。. 由此可见：一定浓度的渗透压更利于阿卡波糖高效合成的作用机制在于阿卡维基转移酶酶蛋白的β-折叠比例上升，增加了麦芽糖结合位点的数量，提高了阿卡波糖前体物质——麦芽糖转运过程的结合和转运效率，从而促进了阿卡波糖的合成。. 本项目的研究可为基于渗透压调控的阿卡波糖工业化发酵工艺优化提供理论指导。