mitoNEET在细胞铁硫簇转运中的作用及调节机制研究

As a group of the most ancient redox centers in living organisms, iron-sulfur clusters are required for many important physiological processes. In eukaryotic cells, iron-sulfur clusters are mainly assembled in mitochondria, and transported into cytoplasm or other organelles for maturation of iron-sulfur proteins. However, the mechanism underlying the iron-sulfur cluster assembly in proteins is still poorly understood. Human mitoNEET, a novel target of type 2 diabetes drug pioglitazone, is an integral outer mitochondrial membrane protein that contains a labile [2Fe-2S] cluster. Deletion of mitoNEET in mice results in a reduced oxidative phosphorylation capacity in mitochondria. In this application, we propose to test a hypothesis that mitoNEET is involved in transporting iron-sulfur clusters from mitochondria to cytoplasm and that such function of mitoNEET could be regulated by zinc ion and type 2 diabetes drug pioglitazone. Specifically, we will investigate: 1) the role of mitoNEET in the iron-sulfur cluster assembly in cytoplasm; 2) the competition of zinc ion for the iron-sulfur cluster binding site in mitoNEET; and 3) the modulation of the iron-sulfur cluster assembly in mitoNEET and subsequent delivery by type 2 diabetes drug pioglitazone. The results are expected to reveal the specific role of mitoNEET in the iron-sulfur cluster assembly in cytoplasm and to provide fundamental information for developing new therapetic approaches for type 2 diabetes.

铁硫簇是在生命活动中起重要作用的氧化还原中心，它在线粒体合成后被运输到细胞质或其它细胞器参与铁硫蛋白的组装，其转运机制尚不清楚。mitoNEET是定位于线粒体外膜且含1个不稳定铁硫簇的低分子量蛋白，它能特异地结合抗2型糖尿病药物吡格列酮。我们前期工作和已有的文献表明，mitoNEET与IscU（铁硫簇合成的支架蛋白）具有相似的结构，且均能结合铁硫簇和锌。推测mitoNEET可能参与铁硫簇从线粒体向细胞质的转运，此功能受锌和吡格列酮调节。为此，本项目拟展开如下研究：1）验证mitoNEET在细胞中铁硫簇的转运作用；2）确定锌在mitoNEET中的结合位点及对铁硫簇结合的相互竞争关系；3）探究锌和吡格列酮对mitoNEET中铁硫簇合成与转运的调节作用。因此，本研究能揭示mitoNEET在细胞中铁硫簇转运中的作用，同时为2型糖尿病新药研发提供重要的药靶信息。

人线粒体蛋白mitoNEET是新近发现的由核基因编码的定位在线粒体外膜上的低分子量蛋白，其含有一个[2Fe-2S]型铁硫中心，该铁硫中心与Cys72、Cys74、Cys83及His87四个氨基酸残基配位结合。MitoNEET作为抗2型糖尿病药物吡格列酮的靶蛋白而被发现，其可能参与多种生命活动过程，包括细胞自噬、凋亡、老龄化、糖尿病及其体内活性氧的平衡等。我们发现锌可以与[2Fe-2S]簇竞争性结合mitoNEET，并且潜在调节mitoNEET的生理功能。以M9作为蛋白表达培养基，在大肠埃希菌中重组表达mitoNNT，其纯化的mitoNEET几乎不含有铁硫簇。在培养基中添加外源性铁或者是锌离子，可以使mitoNEET分别与[2Fe-2S]簇或锌结合。mitoNEET上氨基酸残基位点的突变降低了其上锌结合活性，暗示锌离子与[2Fe-2S]簇在mitoNEET上共有相同的结合位点。最后，过量锌会有效抑制大肠埃希菌中[2Fe-2S]簇与mitoNEET组装，暗示着锌离子通过阻止mitoNEET与[2Fe-2S]簇的组装从而阻碍其功能。此外，生物硫醇和过氧化氢可以调控人线粒体外膜蛋白mitoNEET的氧化还原状态。体外实验中，mitoNEET蛋白可以直接将铁硫簇传递给目的蛋白，如fdx、aconitase 1等。本实验研究在真核细胞水平下，低表达mitoNEET会抑制细胞增殖速率。另外低表达mitoNEET仅在不影响细胞质中aconitase 1蛋白水平而降低其酶活性，对其他线粒体内外铁硫蛋白活性无明显影响。结果表明mitoNEET参与传递铁硫簇给细胞质中的aconitase 1。而高表达mitoNEET不影响线粒体内外铁硫簇水平，包括aonitase 1、2的蛋白表达和酶活性均没有显著变化。在低表达mitoNEET细胞株中转染野生型mitoNEET表达质粒的细胞可以恢复其细胞质的aconitase 1的酶活性同时不影响该蛋白表达。转染mitoNEET突变型（H87C和H87S）表达质粒的细胞虽然能使细胞中mitoNEET的RNA和蛋白表达水平恢复，但是不能使之前低表达mitoNEET导致aconitase 1的酶活性降低恢复，同时此过程中aconitase 1的蛋白表达也没有明显变化。这说明His87是其重要的活性位点。