乙肝病毒X蛋白与PP2A相互作用参与肝癌信号转导的机制研究

乙肝病毒x基因（HBx）与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关，但其具体的分子机制仍不清楚。申请者在前期研究中发现HBx羧基端缺失40个氨基酸的突变体可促进肝癌细胞增殖、加速细胞由G1→S期的进程，在基因和蛋白水平上调羧肽酶D（Carboxypeptidase D，CPD）；后者既可与乙肝病毒、也可与蛋白磷酸酶2A（PP2A）相互结合。推测HBx蛋白（HBX）可通过CPD或直接与PP2A结合，影响多种信号转导途径，共同参与肝细胞癌的发生和发展。本课题以HBX与PP2A的相互作用为切入点，拟进一步运用基因转染和SiRNA等分子和细胞生物学技术，从体外和体内两个水平研究（1）HBX与PP2A的相互作用关系；（2）PP2A参与肝细胞癌增殖调控及可能的信号转导途径。研究结果将对阐明HBX参与细胞信号转导的作用机制和HBX致HCC分子机制提供新的理论依据，并为HCC的治疗提供新的具有潜在价值的靶点。

乙肝病毒x 基因（HBx）与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关，但其具体的分子机制仍不清楚。本项目的方向为研究HBX及HBX-40与CPP2A及CPD相互作用对肝癌发生发展的影响及机制。首先我们在内源性高表达PP2A的Huh7肝癌细胞株中，进行HBX及HBX-40的过表达，结果显示HBX及HBX-40可显著促进Huh7细胞的增殖、克隆形成、周期进程及体内成瘤能力。对HBX阳性的Hep3B细胞株，进行PP2A的干扰，结果显示PP2A干扰后，Hep3B细胞的增殖，克隆形成、周期进程及体内成瘤能力显著下降。这一结果提示HBX与PP2A之间可能存在相互作用，共同促进肝癌的进展。因此，进一步采用免疫共沉淀的方法，研究HBX与PP2A及CPD之间是否存在相互作用，结果显示HBX与PP2A及CPD三者之间存在相互结合，提示其形成的复合体可能参与肝癌的发生发展。为进一步探索它们影响的下游信号通路，因此采用RT-PCR芯片的方法探索PP2A干扰后的信号通路改变，结果发现有11个基因下降2倍以上，9个基因发生上调2倍以上。在这边表达改变的基因中，许多是已知与肿瘤发生发展密切相关的基因，如BCL-2是凋亡抑制因子下降30余倍，表皮生长因子受体EGFR下降4倍，脂肪酸合成酶FAS下降8倍。在发生上调的基因中，如BBC3是促凋亡因子，它可直接结合BCL-2从而促进凋亡，BBC3发生近12倍的增加；CDKN1B（P27）是抑癌基因，它上调近31倍，可抑制细胞的增殖。然而PP2A改变后下游基因是如何协调关联，从而达到抑制细胞增殖促进凋亡的效应，其具体机制有待于进一步的研究。最后在临床样本中分析了人体肝细胞癌组织HBx 羧基端缺失突变与CPD 和PP2Ac 表达的相关性。本项目的科学意义在于阐释了HBX及HBX-40均可与PP2A及CPD相互作用，共同参与肝癌的发展；并在此基础上探索了其参与的下游信号传导通路，初步找到了一些相关的重要下游分子，为进一步探索其机制提供了重要机制，同时也为肝癌的治疗提供重要的理论基础。